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Image showing sets of test tubes used for experiments.

Overview
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アポトーシスは、細胞の再生のために自己破壊するか、異常な細胞増殖を制御するように細胞に信号を送る組織化されたプロセスです。 細胞が損傷するか、不要になると、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死が起こります。これは、胚発生および組織の恒常性の間に発生する通常の生理学的プロセスです。 アポトーシスは損傷した細胞の秩序ある死を制御しますが、壊死は組織の損傷の結果として発生し、損傷した細胞と周囲の細胞の両方の喪失を引き起こします

 

 

アポトーシスのメカニズム

アポトーシスのプロセスは、ある種の形態学的特徴を有します。それらは、細胞膜の変化(膜対称性の喪失、膜接着の喪失など)、細胞質と核の凝縮、タンパクの切断、およびDNAのヌクレオソーム間切断などを含みます。プロセスの最終段階で、死につつある細胞は「アポトーシス小体」へと断片化した状態になり、その結果周囲の細胞に有意な炎症性傷害を及ぼすことなく、食細胞によって除去されます。

 

しかし、ある種の細胞はアポトーシスに特有の特徴を示しません。この場合、細胞死のメカニズムを確認するには、アポトーシスの複数の側面を解析します。

 

この多様な研究をサポートするために、BD バイオサイエンスは、アポトーシスの各段階を解析するツールおよび技術を提供いたします。フローサイトメトリー、バイオイメージング、顕微鏡(生細胞および固定細胞の分析)から、ELISA、IHC、ウェスタンブロット 、蛍光分光分析に至るまで、多彩な方法を提供いたします。

Diagram showing apoptosis of external phosphatidylserine.
Diagram showing the cellular process and steps for apoptostis compared to cell viability.

細胞処理方法別、アポトーシスまたは細胞死の検出方法  

Diagram showing steps for apoptoic cells broken down between intact cells, cell extracts, and tissue sections.
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Apoptosis Detection Methods
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細胞もしくは組織の違いによるアポトーシスの検出方法

Annexin V—アポトーシスシグナル伝達の主要タンパク

細胞膜の変化は、生細胞で検出されるアポトーシスプロセスの最初の特徴の1つです。通常は細胞膜の細胞質側に位置するフォスファチジルセリン(PS)の存在によって検出することが出来ます。アポトーシスの間、PSは細胞膜の外葉に移動し、カルシウム存在下、蛍光色素でラベルしたAnnexin Vに結合することにより、フローサイトメトリーや細胞イメージングによって検出することができます。

 

BD Biosciencesは、様々なレーザーに対応できるようにFITC, PE, BD Horizon BV421やBD Horizon BUV395がラベルされたannexin Vを提供しています。これらの新しく追加されたアネキシン試薬により、より実験の可能性が広がることを期待します。

 

細胞膜が損傷すると細胞内Annexin Vも露出されるので、死細胞を除外するため、アポトーシスを起こした細胞と既に死んでいる細胞を区別する、7-AAD等の細胞膜不透過性染色剤が一般的に用いられます。Annexin Vで染まった細胞集団は、アポトーシスを起こした細胞集団を表しています。

 

Result of control Annexin V BD Horizon<sup>™</sup> V450.
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Result of low RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.
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Result of high RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.
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Annexin V -V450によるアポトーシス、壊死、および細胞死のモニター 

Annexin V -BD Horizon V450によって、低用量のセツキシマブターゲット化金ナノパーティクルで処理した膵がん細胞株のラジオ波(RF)照射量依存のアポトーシス、壊死、および細胞死をモニターした。RF域出力が増すにつれて、温度が上昇し、アポトーシス(右下部)から明らかな壊死(左上部)へのシフトが認められる。

 

 

切断型Caspases及びPARPの測定

アポトーシスメカニズムの1つは、Caspasesと呼ばれる一連の細胞質ゾルプロテアーゼの活性化です。 カスパーゼは、アポトーシスの初期段階でアスパラギン酸残基が切断されると活性化されます。 次に、活性化Caspasesは、ポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)、他のカスパーゼ、および他のタンパク質基質をまとめて含む多くのタンパク質を切断することができます。 これは細胞の構造と機能の喪失につながり、最終的には細胞死を引き起こします。 Caspases-9、-8、および-3はアポトーシスに関与しており、ミトコンドリア経路のCaspases-9、Fas / CD95経路のCaspases-8、さらに下流のカスパーゼ-3が複数の経路によって活性化されます。

BD Biosciencesは、Caspases、特にCaspases -3を測定するためのさまざまな試薬を扱っています。 それらには、活性型のCaspasesに対してのみ向けられた抗体が含まれます。 これらの抗体はさまざまな形式で入手でき、flow cytometry、imaging、ELISA、western blotに使用できます。

 

BD Biosciencesは、蛍光ペプチド基質および阻害剤からキット、すぐに使用できるアッセイプレートまで、Caspases活性アッセイ用のさまざまなツールも提供しています。 活性なヒトまたはマウスのカスパーゼによるタンパク質分解切断により蛍光を発するすように設計された合成テトラペプチド基質の使用に基づいています。 個々の合成テトラペプチド基質は、Caspases阻害剤および活性Caspases酵素とともに、Caspases活性アッセイの実験計画に柔軟性を提供します。

 

Diagrams showing stages of cleavage and inhibition.
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抗 活性型Caspase-3抗体を用いた、アポトーシスを起こしている細胞と起こしていない細胞集団のフローサイトメトリー分析 

 

Jurkat T細胞(A、A1)またはマウス胸腺細胞(B、B1)は、無処理のまま(A、B)、あるいはカンプトテシン(A1)またはアポトーシスを誘導するマウスFasモノクローナル抗体クローンJo2(Cat. No. 554254)(B1)で4時間処理した。膜透過した後、PEと接合した活性型Caspase3抗体(Cat. No. 557091)で染色した。無処理の細胞は基本的に活性型Caspase-3陰性であったが、アポトーシス誘導処理をしたそれぞれの細胞集団の約半分が活性型Caspase-3陽性であった。

 
Data showing relative cell number of untreated and treated cells using camptothecin and mous Fas mAb.
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Obtain the complete picture

Caspasesとannexin Vに加えて、Bcl-2ファミリー、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ファミリー、PARP、その他のシグナル伝達分子など、アポトーシスの研究に重要な他のいくつかのタンパク質があります。 

 

保存されたBcl-2相同性(BH3)ドメインの存在によって識別されるBcl-2ファミリーのメンバーは、アポトーシスの多目的な重要な調節因子です。 たとえば、Bcl-2は、ミトコンドリア膜と結合し、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出を防ぐことにより、細胞をアポトーシスから保護します。 対照的に、Baxなどの他のBcl-2ファミリーメンバーはアポトーシスを促進します。 Bcl-2のレベルの上昇が癌で報告されています。

 

TNFRファミリーには、CD95を含む多くのメンバーが含まれており、構造に基づいて3つの主要なグループに分けることができます。 TNFR経路を介したシグナル伝達はアポトーシスにつながります。

 
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PARPは、DNA鎖切断によって活性化されるDNA修復酵素です。 Caspase-3によるPARPの24および89kDaフラグメントへの切断は、PARP酵素を不活性化します。

 

BD Biosciencesは、アポトーシスの有用なマーカーであるPARPの切断産物に特異的な抗体を持っています。 これらの抗体はさまざまな形式で入手でき、他のマーカーと組み合わせて細胞に関する追加情報を取得できます。

Apoptosis Tools and Resources
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アポトーシス研究を合理的に行うためのツール

 

アポトーシスは、ある種のサイトカイン、タンパク間相互作用、および化学物質等で誘引されます。アポトーシスが開始されると、ミトコンドリアの膜電位変化が起こりますが、これは、BD™ MitoScreen (JC-1) フローサイトメトリーキットで測定が可能です。

 

DNAの断片化は、アポトーシスの最後段階の1つで、アポトーシス過程におけるエンドヌクレアーゼの活性化に起因しています。アガロースゲル電気泳動や末端標識等によって、DNA断片を単離・分離することを含むDNA断片化の研究のため、いくつかの確立された方法があります。DNA断片化の測定では、BD™ APO-BrdU キットで使用されている末端標識法、あるいはterminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick end labeling (TUNEL法)を使います. このアッセイでは、TdTが、二本鎖および一本鎖DNAの3’ヒドロキシル(OH)末端へのbromolated deoxyuridine triphosphate(Br-dUTP)の鋳型非依存的付加を触媒します。二本鎖および一本鎖DNAへBr-dUTPが取り込まれた末端部位は、標識した抗BrdUで細胞を染色することによって、フローサイトメトリーで特定します。対照的にBrdU増殖アッセイは、新たに合成されたDNAや、DNA鎖切断部位にBrdUを取り込ませます。

 

アポトーシスの終わりに、細胞は死細胞状態になります。 したがって、アポトーシス細胞を壊死細胞または死細胞から区別することは、アポトーシス集団を分離するための鍵となります。 BDは、エステラーゼ活性プローブや膜完全性色素など、死細胞を同定するための多くの生存率の高い製品を提供しています。

 



メカニズム アッセイ 主な特徴
細胞膜変化

(ホスファチジルセリンの露出)
Annexin 結合アッセイ

・標識を施した単品

・Annexin V キット
  • 早期アポトーシスマーカーの検出
  • 迅速且つ簡単
  • フローサイトメトリーまたは免疫蛍光用
spectrofluorometryよる活性型Caspase Caspase activity assay kits and reagents 迅速かつ簡便
immunoassayよる活性型Caspase Active caspase-3 immunoassays, including active caspase-3 conjugates 固定もしくはLyset状態にした細胞のELISA, フローサイトメトリー もしくは western blot
生細胞活性プローブによるCaspase活性 Active caspase-3 live cell caspase probes:

BD Pharmingen Yellow-Green Live Cell Caspase Probe

BD Pharmingen Blue Live Cell Caspase Probe

BD Pharmingen Violet Live Cell Caspase Probe
フローサイトメトリー

未固定細胞のCaspase活性の測定が可能
主要なたんぱく質の活性 シグナルタンパク質:

Cleaved PARP

Bcl-2

CD95

H2AX
フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光法に利用できます

複数のフォーマットで利用可能であり、他のアポトーシスおよび生存率ツールとの多重化を可能にして、関心のある集団のより良い特性評価を可能にします
ミトコンドリアの変化 BD® MitoScreen Kit

BD Pharmingen MitoStatus TMRE

BD Pharmingen MitoStatus Red
フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡による迅速で簡単な単一細胞の分離
DNAの断片化 APO-BrdU TUNEL Assay

APO-DIRECT TUNEL Assay
接着細胞で使用可能

フローサイトメトリーで単一細胞レベルでの解析可能

細胞周期分析と組み合わせ可能
エステラーゼ活性 BD Pharmingen Calcein AM

BD Pharmingen Calcein Blue AM
フローサイトメトリーにより、未固定細胞の生存率を測定
膜透過性の核染色 Propidium Iodide

7-AAD

DAPI

DRAQ7

BD Via-Probe Green Nucleic Acid Stain

BD Via-Probe Red Nucleic Acid Stain
色素を透過する死細胞の核酸を染色することにより、フローサイトメトリー用の未固定細胞の生存率の測定

パネル設計を容易にするために様々なレーザーに対応可能
色素排出機能 BD Horizon Fixable Viability Stains 無傷の細胞の表面と死んだ細胞の表面と内部を染色することにより、フローサイトメトリー用の固定細胞の生存率を測定

パネルデザインを容易にするために10色で利用可能


圧倒的な数の利用可能な技術と製品があるため、最も適切な方法を選択することはしばしば困難です。 この選択を容易にするために、上記は生物的観点からまとめたものです。


アポトーシス、細胞周期、DNA損傷の同時測定

アポトーシスと細胞増殖アッセイは、基本的な癌の研究と創薬に特に役立ちます。 異なる実験間でデータを比較することは、サンプルの取り扱い、タイミング、およびサンプル内の変動性によってもたらされる変動性のために困難な場合があります。

 

マルチカラーフローサイトメトリーはこれらの課題に対処し、アポトーシスと細胞増殖を研究するための優れたツールです。 関連するマーカーを細胞表現型マーカーと組み合わせて、細胞の亜集団内のイベントを調べることができます。 リンタンパク質に対する抗体は、リン酸化イベントを調べるために使用できます。

 
Data sets comparing cleaved PARP Alexa®Fluor and PhosphoH2AX AlexaFluor®647 results.
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For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.

APO-BRDU and APO-DIRECT are trademarks of Phoenix Flow Systems. DRAQ5 is a trademark of BioStatus Ltd. Triton is a trademark of Dow Chemical Company.