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A series of test tubes in a laboratory.

Overview
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Bリンパ球またはB細胞は、胎児の肝臓と出生後の骨髄で成熟を開始する適応免疫細胞のサブセットです。B細胞は、抗体の産生を通じて体液性免疫をサポートする能力で知られていますが、食作用や抗原提示などの他の重要な機能を担っています。B細胞系統に関与する細胞はCD19を発現し、他のマーカーは成熟と分化の間に進化します1。B細胞は免疫系で重要な役割を果たすため、活発な研究分野です。B細胞の発達または機能の摂動は、いくつかの病状に関係しています。B細胞の機能と機能不全の基礎を理解することは、新しいワクチンと治療法の開発にとって特に興味深いものです。細胞内および表面マーカーから分泌タンパク質および機能アッセイまで、BD Biosciencesは、健康および疾患におけるB細胞生物学を研究するための最新の試薬および方法を提供します。

 

B細胞はどのように発達しますか?

B細胞は、抗原への曝露の前後で多くの発達段階を通過します。成熟して分化するにつれて、複数の機能的に異なるサブセットを生じます。細胞表面および細胞内マーカーの差次的発現、ならびにそれらの異なる免疫グロブリンおよびサイトカイン分泌プロファイルは、異なるB細胞サブセットの多様な性質および機能への貴重な手がかりを提供します。たとえば、syndecan-1(CD138)の発現は、循環する形質芽細胞と形質細胞、つまり“professional” antibody-secreting B cellsを、他のサブセットから区別します。発達過程が正常に完了しないと、成熟中のB細胞にアポトーシスが誘導されます。B細胞の研究のマルチカラーフローサイトメトリーをサポートするために、BDはB細胞表現型のための試薬の幅広いポートフォリオを提供しています。新しいマーカーが出現するごとに、新しい特異性を追加し続けます。概略図は、マウスとヒトの各B細胞サブセットに関連する主要な発生段階と分化段階、およびいくつかの重要なマーカーをまとめたものです。

 

従来のB細胞成熟

B細胞は、骨髄にある造血幹細胞(HSC)に由来し、そこで発生の最初の段階を通過します。その後、まだ未成熟なB細胞は二次リンパ組織に移動し、そこでそれらのほとんどは成熟した濾胞性B細胞へと発達し続けます。 IgMおよびIgDの膜結合(m)型からなる成熟B細胞のB細胞受容体(BCR)複合体がその同族の外来抗原に結合すると、細胞は活性化され、抗体分泌形質細胞に分化します2

 
Diagram showing B cell maturation stages.
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異なる機能を持つB細胞サブセット

B細胞は従来のB細胞とは別の分化経路をたどり、異なる機能とマーカー発現パターンを持つサブセットをもたらします。たとえば、辺縁帯(MZ)B細胞は先天性のような細胞として機能します。従来のB細胞とは異なり、BCRをバイパスして、Toll様受容体(TLR)ライゲーションを介して活性化することができます。また、CD1dとCD21を発現する傾向がありますが、CD23は発現しません。調節機能を持つB細胞サブセットが同定されており、IL-10またはTGF-β-1.3を分泌する能力によって区別されています3

 

B細胞成熟の分析

マウスおよびヒトマーカーに対する抗体の包括的な選択により、BDは、すべての発達段階にわたるB細胞の研究のための多種多様な表現型パネルをサポートします。7つの細胞表面マーカーを使用してマウス骨髄のB細胞サブセットを分析し、この組織の7つの異なる発達段階の識別を可能にしました。Pre-pro-B、Pro-B、およびPre-B細胞は、BP1およびCD24の差次的発現に基づいて、低陽性CD45R / B220集団内で区別できます。IgMとIgDの差次的発現に基づいて、未成熟、移行期、初期および後期の成熟B細胞を分離することができます。IL-7受容体であるCD127の発現は、異なるサブセットで分析され、B細胞が成熟するにつれて減少することが示されました。

 
Data sets showing analysis of bone marrow b-cells.
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References

  1. Martínez-Riaño A, Bovolenta ER, Mendoza P, et al. Antigen phagocytosis by B cells is required for a potent humoral response. EMBO Rep. 2018;19(9):e46016. doi:10.15252/embr.201846016

  2. Yam-Puc JC, Zhang L, Zhang Y, Toellner KM. Role of B-cell receptors for B-cell development and antigen-induced differentiation. F1000Res. 2018;7:429. doi:10.12688/f1000research.13567.1

  3. Matsushita T. Regulatory and effector B cells: Friends or foes? J Dermatol Sci. 2019;93(1):2-7. doi:10.1016/j.jdermsci.2018.11.008
B Cell Types
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B細胞の種類

プラズマ細胞

B細胞は、外来体や感染細胞を中和するのに不可欠な抗体を産生する能力でよく知られています。形質芽細胞および形質細胞を含む抗体分泌細胞(ASC)は、CD20 B細胞マーカーを欠いており、ヒトではCD27、CD38、およびCD138の組み合わせを発現します。形質芽細胞は、適応免疫応答の初期に作用し、低親和性の免疫グロブリンを産生し、寿命が短いです。形質細胞はより分化しており、短命と長命のサブセットを含みます。短命の形質細胞は、寿命と抗体分泌速度が形質芽細胞と類似しており、形質細胞はすべての免疫グロブリン(Ig)アイソタイプを発現しますが、形質細胞はIgMとIgGを優先します。長寿命の形質細胞は、IgG> IgA> IgMである免疫グロブリン(Ig)アイソタイプで、最長の寿命と最高の抗体分泌率を示します4

 

エフェクターB細胞

エフェクターB細胞またはB-effは、抗原提示を介して免疫応答をサポートする役割を果たし、一連のサイトカイン(IL-2、IL-6、GM-CSF、IL-12、IL-17、IFN-γなど)を分泌します。 TNF-α)は、マクロファージ(例、インターフェロン-ガンマ)の活性化、T細胞分化(Th17の場合はIL-6)、および抗体産生のための血漿細胞分化を誘導します3。エフェクターB細胞は、血漿細胞分化をサポートすることにより、無秩序な免疫応答にも寄与します全身性紅斑性狼瘡(SLE)や多発性硬化症(MS)などの自己免疫疾患における自己抗体産生のため。MSでは、CD138 + B細胞が脳脊髄液(CSF)に蓄積し、炎症性サイトカインの分泌とミクログリアの活性化を通じて中枢神経系の慢性炎症の維持に寄与することが示されています5

 

調節性B細胞

B細胞はサイトカインを分泌して免疫細胞の機能を調節するため、免疫細胞から環境シグナルを受け取り、免疫細胞の機能を調節します。自己免疫では、エフェクターB細胞と調節性B細胞(B-reg)のバランスは、マクロファージと樹状細胞由来のBAFFによって誘導されます。SLEでは、過剰なBAFFは、IL-10産生B-regの活性化を阻害しながら、形質細胞による自己抗体産生を促進します。これらのIL-10分泌調節B細胞のほとんどは、CD9(88%)および腫瘍壊死因子受容体2(TNFR2)の発現によって同定できます3, 6

References

  1. Tellier J, Nutt SL. Plasma cells: The programming of an antibody-secreting machine. Eur J Immunol. 2019;49(1):30-37. doi:10.1002/eji.201847517

  2. Matsushita T. Regulatory and effector B cells: Friends or foes? J Dermatol Sci. 2019;93(1):2-7. doi:10.1016/j.jdermsci.2018.11.008

  3. Knier B, Hiltensperger M, Sie C, et al. Myeloid-derived suppressor cells control B cell accumulation in the central nervous system during autoimmunity. Nat Immunol. 2018;19(12):1341-1351. doi:10.1038/s41590-018-0237-5

  4. Fillatreau S. Regulatory functions of B cells and regulatory plasma cells. Biomed J. 2019;42(4):233-242. doi:10.1016/j.bj.2019.05.008
Assays for B Cell Function
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B細胞機能を評価するためのアッセイ

抗体産生

B細胞によって分泌される免疫グロブリンとサイトカインの種類と量の測定は、それらの免疫応答の質と量への洞察を提供します。これは、病状でも頻繁に変化する特徴です。

マルチプレックス測定を可能にする方法は、免疫グロブリン(Igs)とサイトカインを測定するためにますます使用されています。マルチプレックス分析の利点に加えて、古典的に使用されている手法と比較して、いくつかの独自の利点があります。

 

BD®サイトメトリービーズアレイ:マルチプレックス定量

BD® Cytometric Bead Array (CBA) は、同じサンプルから複数の分析物を同時に定量化できるビーズベースのイムノアッセイです。BD®CBAHumanImmunoglobulinFlex Setシステムは、複数のIgサブクラスのマルチプレックス定量のビルディングブロックとして機能する、すぐに使用できる試薬を提供します。特定の免疫応答における抗体の量と種類は大きく異なる可能性があるため、これらのパラメーターの測定は、免疫またはワクチン接種後の応答への洞察を提供したり、免疫グロブリン欠乏障害を評価するための指標として役立ちます。たとえば、BD®CBAアッセイは、炎症中にB細胞から分泌されるIgおよびサイトカインを分析するために使用されてきました7

 

サイトカイン産生

B細胞は、その活性化状態に基づいて、さまざまなサイトカインを分泌します。


Cell Type Cytokines Secreted
B effector 1 (Be-1) IFN-γ, IL-12, TNF
B effector 2 (Be-2) IL-2, IL-4, IL-6. TNF
Regulatory B IL-10, TGF-β1

 


サイトカインのBD®CBAアッセイ

BD® CBA Flex Setsは、簡単で効率的な多重化のために設計されたビーズベースの試薬のオープンで構成可能なメニューを提供します。特異性には、広範囲のヒトおよびマウスのサイトカインが含まれます。BD®CBA標準を使用した結果をNIBSC / WHO国際標準と比較するデータは、さまざまな研究所または方法で決定されたサイトカイン濃度値の比較を容易にするためのガイドラインとして利用できます。どのサイトカインが分泌されるかを測定することで、サンプル中のさまざまな機能的B細胞サブセット、例えば、Bエフェクター-1や-2、またはIL-10などの抗炎症性サイトカインを分泌する調節性B細胞(B-reg)の活性に関する情報が提供されます8,9

 


細胞内シグナル伝達

B細胞の発達、活性化、分化には、転写因子、リン酸化シグナル伝達タンパク質、サイトカインなど、細胞内分子の多くの変化が伴います。BDは、これらの細胞内分子の分析を独自に可能にするソリューションを提供し、研究者がB細胞生物学を調節する相互接続された経路を解読するのをサポートします。マルチカラーフローサイトメトリーは、細胞内分子を分析するための強力な手法です。特定の細胞サブセットのマーカーを使用した同時分析により、B細胞の異なる集団の分化と活性化状態に関する情報を明らかにすることができます。細胞表面染色の手法は比較的標準的ですが、細胞内マーカーの最適な染色は、多くの場合、標的タンパク質の生物学に依存します。

 
Diagram showing stain cells as they permeate cells.
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フローサイトメトリーによるこれらの特定の細胞内分子の検出を容易にするために、BDはモノクローナル抗体、特殊なバッファーシステムおよびキットを開発しました。フローサイトメトリーには、ウエスタンブロッティングなどの一般的に使用される方法に比べていくつかの利点があります。血液などの異種サンプルから複数のパラメーターを同時に測定できます。これは貴重なサンプルを保存し、細胞レベルで詳細な結果を提供します。

 

細胞内染色の基本原理。細胞は固定され、透過処理され(破線の膜で表されます)、染色され、フローサイトメトリーで分析されます。分泌されたタンパク質の研究では、細胞を最初にタンパク質輸送阻害剤で処理して、細胞内に標的タンパク質を蓄積させます。

 
Data sets showing CD95 PE and Bcl-6 AlexaFluor®488 FITC
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転写因子の検出

BD Pharmingen™ transcription factor bufferは転写因子サイトカイン同時解析用バッファーで、細胞を適切に固定・膜透過処理することができ様々な核内エピトープを測定することができます。また、細胞表面マーカーとの組合せにも最適です。

 

BD は、濾胞B細胞やGC B細胞で発現しているOct-2, Pax-5、増殖時GC B細胞で発現しているBcl-6、形質細胞で発現しているBlimp-1,XPB-1sなどB細胞関連転写因子の抗体を広く取り揃えています.

 
Charts detailing PE Isotope and PE mTOR results for Alexa Fluor®647 CD20.
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リン酸化タンパクの検出

BD Phosflow™抗体は、リン酸化エピトープに対して特異的な抗体です。また、これらの抗体は、フローサイトメトリーで検出できるようバリデーションされており、膜固定・透過処理剤との組み合わせが検証されています。BD Phosflow™ perm buffer III は、多くのリン酸化エピトープの検出に最適な膜透過剤ですが、その他にも実験系に合わせたバッファーを揃えています。

BD Phosflow抗体は、B細胞の分化や活性化に関するシグナル伝達経路の解析に有用です。例えば、phospho-Akt, phospho-Btk, phospho-Syk, phospho-BLNK, phospho-CD20/ BL-CAM, phospho-IKKγ, phospho-NFκB, phospho-mTORなどをご用意しています。

 
Data sets for PE B220 and AlexaFluor™647 results.
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サイトカインの検出

サイトカインは典型的な分泌タンパクなので、細胞内タンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。 その後、緩やかな固定膜透過を行い測定します。細胞内フローサイトメトリーによる、活性化細胞におけるサイトカイン産生能の解析は、非常に簡単で、標準的な手法が確立されています。さらには、転写因子などとも同時に測定することも可能ですので、各細胞サブセットの分化解析もおこなうことができます。

 

BDは、サイトカインと細胞表面マーカーの検出を簡単に行うためのキットやバッファー、豊富な抗体製品ラインをご提供しています。特に抗体に関しては、様々な条件、バッファーに対応する、細胞表面マーカーやサイトカインに対する蛍光標識抗体をご用意しております。例えば、BregやBe-1, Be-2といった細胞が分泌するサイトカインに対する抗体も取り揃えております。また、BD Cytofix/Cytoperm bufferはサイトカイン産生能の解析においては、数多くの文献で引用されている実績があります。

 
Data showing PerCP-Cy5.5 CD 20 results.
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References

  1. Lu Y, Liu F, Li C, Chen Y, Weng D, Chen J. IL-10-producing B cells suppress effector T cells activation and promote regulatory T cells in crystalline silica-induced inflammatory response in vitro. Mediators Inflamm. 2017;2017:8415094. doi:10.1155/2017/8415094

  2. Kardava L, Moir S, Wang W, et al. Attenuation of HIV-associated human B cell exhaustion by siRNA downregulation of inhibitory receptors. J Clin Invest. 2011;121(7):2614-2624. doi:10.1172/JCI45685

  3. Ambegaonkar AA, Kwak K, Sohn H, Manzella-Lapeira J, Brzostowski J, Pierce SK. Expression of inhibitory receptors by B cells in chronic human infectious diseases restricts responses to membrane-associated antigens. Sci Adv. 2020;6(30):eaba6493. doi:10.1126/sciadv.aba6493
B Cell Immunophenotyping
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B細胞免疫表現型検査のためのツール

B細胞の研究はT細胞よりも多くのマーカーを使用する必要があるため、マルチカラー解析アプローチが非常に適しています。

 

バックボーンマーカー

多種多様なB細胞研究では、主要なB細胞サブセットを定義する細胞表面マーカーを採用しており、これらはパネルがより詳細な分析を行うための「バックボーン」またはコアを形成します。B細胞パネルの重要なマーカーは系統マーカーCD19であり、これはB細胞系統に属するほぼすべての細胞によって発現されます。マウスでは、CD45R / B220が伝統的に使用されています。BCRアイソタイプはB細胞の分化段階に関する情報を提供するため、ほとんどのパネルには表面発現IgDおよびIgMも含まれています。パネルデザインに柔軟性を提供するために、BDはこれらすべてのマーカーを幅広いフォーマットで提供しています。

 

マルチカラーフロー

5つのマーカーのパネルを2つのレーザーで測定すると、通常使用される蛍光色素は他の蛍光チャネルへのスピルオーバーを示すため、補正が必要です。4つまたは5つのレーザーを備えた機器にアクセスできる研究者は、この機能を利用してセットアップを簡素化し、補償の必要性を最小限に抑えることができます。

 

マルチカラーフロー用の機器セットアップ

4色以上の抗体パネルを使用した多色実験用の機器のセットアップには時間がかかる場合があります。5レーザー機器には、多くの場合355 nm UVレーザーが装備されています。これは通常、サイドポピュレーション分析、indo-1を使用したカルシウム測定、または生存率染色に使用されます。

ユーザーが表現型実験にこの装置を最大限に活用できるようにするために、BDは新しいUV励起ポリマーベースの色素であるBDHorizonBrilliant™Ultraviolet 395(BUV395)を開発しました。

 
Data sets showing SSC panels with various results.
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BUV395に結合した抗体を、各蛍光色素が異なるレーザーによって励起されるパネルに組み込むと、それらの間の波及効果が最小限になるか、まったくなくなります。これは、ナイーブ細胞とメモリーB細胞を区別する5色のパネルの例で示されています。このパネルを使用すると、最小限のセットアップのみで、実質的に補償は必要ありませんでした。

 

示されている例では、9つの細胞表面マーカーを使用してマウス脾臓のB細胞サブセットを分析しました。それらは、この組織に存在する異なる発達段階の間の識別を可能にしました。IgM、IgD、CD21およびCD23の発現に基づいて、濾胞性BIおよびIIと辺縁帯細胞サブセット(辺縁帯および辺縁帯前駆細胞)が同定されました。異なるレベルのIgMおよびCD23発現は、移行サブセット(T1、T2、およびT3)の段階を区別するのに役立ちました。異なるサブセットにおけるPax-5の発現の測定により、卵胞および辺縁帯B細胞における異なるPax-5発現が明らかになりました。

 
Data sets showing AlexaFluor®700 and CD45 results.
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測定値を組み合わせて結果を最大化する

バッファーシステムと方法論の進歩により、表面マーカーと細胞内マーカーの両方を同時に測定することが容易になり、研究者は情報が豊富な複合測定に移行することができます。たとえば、分化中のB細胞の異種サンプルのいくつかの細胞タイプは、細胞表面と細胞内マーカーの組み合わせを使用して監視し、各サンプルからより関連性の高いデータを効率的に取得できます。新しいBDHorizon™Dyesを含む多くの異なるコンジュゲートにおけるB細胞表面マーカーと特定の転写因子の両方に対する抗体の可用性は、多色実験を設計する際の柔軟性を追加します。

 

ベーシックパネル

分析するサンプルのタイプに応じて、さまざまなマーカーを選択して、目的の特定のB細胞サブセットを定義できます。示されている例では、CD19、CD20、IgD、CD27、CD38、およびCD24を使用してヒト末梢血を分析しています。この6色のパネルを使用すると、移行B細胞(CD24high、CD38high)を識別し、ナイーブ細胞とメモリー細胞(ナイーブ細胞はCD27–IgD +、メモリーセルCD27 + IgD–)を識別し、形質芽細胞(CD38 +)を識別できます。

 
Charts detailing staining results for lymphoctyes and b cells.
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より深い表現型

一部のサブセットの表現型は他のサブセットと非常に類似しているため、多くの場合、より広範な表現型パネルが必要になります。たとえば、パネルは骨髄B細胞に存在する多くのB細胞の発達段階を区別するかもしれません。マーカーを追加すると、たとえば、メモリーセルやさまざまなタイプのプラズマセルを定義するなど、より詳細な分析を行うこともできます。他の分子は、細胞が体内に帰巣して局在化する可能性についての洞察を提供します(ケモカイン受容体、CD62L)。活性化マーカー(CD69、CD25、CD80、CD86)を追加すると、どのサブセットが活性化されているかを通知し、個人の免疫反応に関する重要な手がかりを提供できます。

 

パネルを構築するためのツール

抗原密度。 パネルにマーカーを追加する場合、研究者は抗原密度情報を利用して抗原-蛍光選択を最適化できます。一般に、抗原密度の低いマーカーには明るい蛍光色素を選択し、高発現マーカーには明るい蛍光色素を選択しないことをお勧めします。研究者をサポートするために、BD は末梢血細胞上のいくつかのマーカーの抗原密度に関する情報を生成しています。薄暗いマーカー用の明るいコンジュゲート。特定の 細胞集団は非常にまれであるか、薄暗く発現した抗原によって定義されるため、染色実験で良好なデータを取得するには、十分な解像度を達成することが重要です。特に、このようなまれな集団や薄暗い集団では、非常に明るい蛍光色素を使用すると、解像度が向上します。BV421、BV510、BV605 などの非常に明るい BD Horizon BrilliantViolet™(BV)色素に結合したB細胞マーカー抗体が多数あります。

 
Chart showing antigen density with different factors.
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追加のサブセットを定義するための拡張パネル

示されている10色分析実験に使用されるパネルを設計する際に、抗原密度に関する情報は、蛍光色素の分布を最適化するのに役立ちました。低密度抗原CD138には明るい蛍光色素を選択し、さまざまなレベルのIgDおよびCD38を発現する集団の分離を可能にし、CD27およびIgMの最適な検出を得るために非常に明るいBV色素を使用しました。このパネルを使用した分析により、Igサブクラス発現に関する追加情報が提供され、IgG +およびIgG–ポストクラススイッチメモリーセル(IgM–IgD–CD38–CD27 + / dim)の識別と、形質細胞(IgM–IgD)の明確な識別が可能になりました。 –CD20–CD38 ++)。

 
Charts detailing different data results for 10 different colors.
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References

  1. Finak G, Langweiler M, Jaimes M, et al. Standardizing flow cytometry immunophenotyping analysis from the human immunophenotyping consortium. Sci Rep. 2016;6:20686. doi:10.1038/srep20686

References

  1. Finak G, Langweiler M, Jaimes M, et al. Standardizing flow cytometry immunophenotyping analysis from the human immunophenotyping consortium. Sci Rep. 2016;6:20686. doi:10.1038/srep20686

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