免疫組織化学法

Overview

免疫組織化学法（IHC）は、特異抗体の能力を利用して組織サンプル中の検討対象の抗原を検出するための強力なツールです。IHCは、がん組織の病理学的評価、腫瘍の予後や治療効果の予測、感染の存在の確定、および数々の研究の応用分野において広く用いられています¹。IHCでは、抗原の有無の確認に加え、抗原の分布や位置を特定することも可能です。

Principles of immunohistochemistry

まず、検討対象の組織を固定、パラフィン包埋、あるいは凍結保存し、薄片を作製します。保存切片の処理（パラフィン包埋切片の脱パラフィン、あるいは凍結保存切片の加熱）を行って抗原を回復し、その後、抗原に特異的な抗体を用いて免疫染色します。western blottingやELISAと同様に、IHCにも直接法（1つの抗体のみを使用する方法）と間接法（一次抗体と二次抗体を組み合わせる方法）があります。検出は通常、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリホスファターゼ（AP）などの酵素を用いて行います。サンプルを顕微鏡法により可視化します。

Immunocytochemistry, immunohistochemistry and immunofluorescence—what are the differences?

免疫組織化学法の原理は免疫細胞化学法（ICC）の原理と似ていますが、ICCは細胞を使用するのに対し、IHCは組織サンプルを使用します

免疫細胞化学法（ICC）、免疫組織化学法（IHC）のいずれでも、解析のために抗原の免疫標識を行い、immunofluorescenceを用います。免疫細胞化学法と免疫蛍光法を特に区別せずに用いられる場合もあります。

ICCでは細胞レベルで解析を行いますが、IHCでは組織全体を調べることができます。いずれの手法も検出には免疫蛍光法を使用します。酵素（例：3,3’-ジアミノベンジジン[DAB]を基質として使用）を用いた検出法を使用することも可能です。

References

Duraiyan J, Govindarajan R, Kaliyappan K, Palanisamy M. Applications of immunohistochemistry. J Pharm Bioallied Sci. 2012;4(Suppl 2):S307-S309. doi: 10.4103/0975-7406.100281

IHC Sample Preparation

Sample preparation for IHC

組織サンプルが得られたら、組織の構造を可能な限りインタクトな状態に保ち、抗原の状態を、抗原採取時点とできるだけ近い状態に維持できるように保存しておくことが極めて重要です。調製方法の選択も、サンプルの保存状態や抗原検出のしやすさに経時的な影響を及ぼします。

どの固定液を選択すべきかは、検出する抗原や解析の種類（例：形態か発現か）によって異なります。

組織の固定：

免疫組織化学法では通常、4%パラホルムアルデヒド（PFA）を用いる方法により組織サンプルを保存します。この固定法では、組織の構造をしっかり保つことができますが、抗原エピトープの適切な検出に支障を来すおそれのある立体構造変化が生じる可能性があります。ホルムアルデヒド誘発性エピトープマスキング対策として、通常は、抗原回復剤を用いて抗原を回収しやすくします。

パラフィン包埋切片には、ホルムアルデヒドの代わりに強度の低い固定液（亜鉛など）を使用することができます。ホルムアルデヒドや亜鉛のほかに、アルコールやアセトンを使用してIHC用サンプルを固定することもできます。

組織の包埋

組織サンプルを固定したら、その組織サンプルをパラフィン包埋して、組織を薄切できるようにします。一般的には、パラフィンを用いて、薄切のためのブロックを作製します。サンプルをスナップ凍結するという組織調製法もあります。凍結は迅速な方法であり、抗原エピトープの保存も可能ですが、凍結時に形成された結晶が組織の構造を変化させるおそれがあります。

組織の薄切

組織の薄切により、免疫組織化学法による実験のための染色の足場となる切片を作製することができます。パラフィン包埋組織を薄切するにはミクロトームが必要ですが、凍結組織はクリオスタットを使用して薄切します。

BD Pharmingen™ IHC Zinc Fixativeは、抗原や組織の形態をインタクトな状態に保つ強度の低い固定液で、白血球マーカーの検出に適しており、ホルムアルデヒド固定組織の構造も同様に保ちます。BD Pharmingen™ IHC亜鉛固定液を、BD Pharmingen™ Retrievagen A溶液（pH 6.0）やPharmingen™ Retrievagen B溶液（pH 9.5）と組み合わせれば、一部のエピトープに対する抗体の反応がさらに高まります。

Antigen retrieval methods for IHC

以下の2つの主要な抗原回復法を用いて、包埋で覆い隠されている抗原エピトープを露出させ、エピトープの免疫反応性を高めます¹。

プロテアーゼ誘発エピトープ回復法（PIER）

酵素的回復法とも呼ばれるプロテアーゼ誘発エピトープ回復法（PIER）は、プロテアーゼの化学反応を利用して、組織固定時に形成された架橋結合を解除するというものです。この手法は通常、復元が困難なエピトープを回復するために使用されます。この手法では中性pH付近の酵素（例：トリプシン、プロテイナーゼK）の緩衝液を使用します。この手法は、非特異的酵素反応を利用した強力な回復法であるため、過剰なインキュベーションにより、検討対象のエピトープと共に組織の構造が損傷するおそれがあります。

熱誘発エピトープ回復法（HIER）

熱誘発エピトープ回復法（HIER）は、熱と加圧を利用して抗原エピトープを回復します。PIERが中性緩衝液を使用するのに対し、HIERでは標的抗原に応じてさまざまなpHを使用することができます。

BD Biosciencesは、BD Pharmingen™ Retrievagen A（pH 6.0）溶液と、Retrievagen B（pH 9.5）溶液の2種類の効果的な抗原回復試薬を取り揃えています。これらの試薬は特に、BD Pharmingen™ IHC Zinc Fixativeで固定した組織と組み合わせて使用するのに適しています。

References

Ireka Y, Agustina H, Aziz A, Hernowo BS, Suryanti S. Comparison of fixation methods for preservation cytology specimens of cell block preparation using 10% neutral buffer formalin and 96% alcohol fixation in E-cadherin and Ki-67 immunohistochemical examination. Open Access Maced J Med Sci. 2019;7(19):3139-3144. doi: 10.3889/oamjms.2019.452.

IHC Detection Methods

Direct and Indirect immunohistochemistry methods

免疫染色法には主要なものとして以下の2つがあります。

直接法

直接免疫組織化学法では、1個の単一結合抗体を用いて検討対象の抗原エピトープを検出します。この手法は、増幅の必要がない大量の抗原を検出するのに用いられます。

間接法

間接免疫組織化学法では、2段階で抗体染色を行います。まず、検討対象の抗原に対する一次抗体を抗原に結合させます。次に、一次抗体種に結合させた二次抗体を用いて、顕微鏡法で検出できるシグナルを生成します。間接免疫組織化学法は、発現レベルが中～低の抗原のシグナルをより確実に検出できるため、広く用いられています。

どの手法を選択すべきかは、いくつかの因子（抗原の存在量、抗原の分布、組織サンプルの調製方法など）によって異なります¹。

IHC detection methods

比色検出

比色または発色免疫組織化学法は、酵素とその基質との反応を利用して、その反応部位を特定する発色沈殿物を生成するというものです。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）とアルカリホスファターゼ（AP）が、この手法で用いられている2つの主な酵素検出系です。BD Biosciencesは、これらの酵素と併用できるさまざまな基質（BD Pharmingen™ DAB Substrate Kitや、BD Pharmingen™ AEC Substrate Kitなど）を取り揃えています。

蛍光検出

蛍光免疫組織化学法では、フルオロフォアに結合させた抗体を使用します。フルオロフォアは、適切な光波長で励起されると、蛍光顕微鏡で可視化できる蛍光シグナルを放出します。BD Biosciencesはさまざまなfluorescence-coupled secondary antibodies for IHCを取り揃えています。

Improving immunohistochemistry staining quality

免疫組織化学染色でより高い可視化効果を得るには、実験を慎重に計画し、適切な組織採取を行い、標的抗原を検出するのに最適なオプションを選択してサンプルを調製する必要があります。

シグナル増幅

シグナルは、単一抗原の複数のエピトープを認識できるポリクローナル抗体を用いて増幅することができます。複数の複合体に結合させた二次抗体や、ポリマー法、アビジン-ビオチン複合体（ABC）法、標識ストレプトアビジンビオチン（LSAB）法などの手法を使用することも可能です。

非特異的結合の減少

BD Biosciencesは、非特異的結合を減らしてシグナルノイズ比を高めるのに役立つブロッキング溶液を取り揃えています。染色時のバックグラウンドノイズを設定どおりに維持する試薬（IHC用BD Pharmingen™ Antibody Diluentなど）もあります。

Sample IHC data generated using BD Biosciences antibodies

抗体や試薬に加え、バリデート済みのprotocols for IHCもご用意しています。

References

Magaki S, Hojat SA, Wei B, So A, Yong WH. An introduction to the performance of immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 2019;1897:289-298. doi: 10.1007/978-1-4939-8935-5_25

本製品は研究用です。診断や治療には使用できません。