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細胞内フローサイトメトリー

Overview

細胞内フローサイトメトリーは、細胞種を同定し、細胞株内や不均一な細胞サンプル中のシグナル伝達や機能的反応を解析するための強力な手法です。Th17 T細胞や制御性T細胞（Treg）などの一部の細胞種については、確実に同定するため、サイトカインや転写因子などの細胞表面・細胞内マーカーを組み合わせて使用する必要があります。また細胞内フローサイトメトリーからは、細胞の機能やシグナル応答に関する豊富な情報が得られます。細胞表面マーカーに特異的な蛍光抗体と、アポトーシス、増殖、タンパク質のリン酸化などのマーカーと組み合わせれば、どの細胞サブセットが各種の刺激や治療に反応しているかを特定することができます。複数のマーカーを組み合わせて使用することで、細胞1個当たりより多くのパラメータを測定することができるため、データ取得時間が短縮され、貴重なサンプルを節約することができます。western blottingやその他の手法は、細胞集団全体によって発現する単一のタンパク質について調べるのに有用ですが、フローサイトメトリーでは個々の細胞レベルで複数のタンパク質を同時に検出することができます。

BD Biosciencesは、細胞内フローサイトメトリーを容易にするための蛍光色素結合抗体・緩衝液・キット・プロトコルを取り揃えています。当社の抗体は、生物学的に関連のあるモデル系で試験が行われています。これらの確立されたツールは、免疫学、炎症、幹細胞生物学などの分野における新たな発見を可能にします。細胞内フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色や、リン酸化タンパク質や転写因子の検出をサポートするツールや手法（BDの蛍光色素結合抗体、緩衝液、キット、プロトコルなど）を見つけてください。

Protocols for intracellular flow cytometry

細胞内染色の基本原理

細胞表面染色のための手法は比較的標準的なものですが、細胞内マーカーを最適に染色できるかどうかは、多くの場合、標的タンパク質の生物学的特性に左右されます。そのタンパク質が細胞内のどこに存在するか、また他の分子との関連性や、そのタンパク質の安定性によって、異なる細胞調製法や細胞染色法が推奨されます。例えば、サイトカインは一般的に分泌タンパク質です。

しかし、サイトカインは、細胞内で捕捉すると、BD GolgiStop™（モネンシン含有）やBD GolgiPlug™（ブレフェルジンA含有）などのタンパク質輸送阻害薬を用いて細胞内タンパク質として染色することができます。サイトカインは、BD Cytofix/ Cytoperm™固定・透過処理液でやさしく固定・透過処理することで、比較的利用可能な状態となります。

サイトカインとは対照的に、転写因子は多くの場合、核内に存在し、DNAや他のタンパク質に結合します。Stat5などの一部のタンパク質のリン酸化により、二量体が形成され、検討対象のリン酸化エピトープが覆い隠されます。また、これらのタンパク質が細胞内ホスファターゼによって急速に脱リン酸化される可能性もあります。そのため、処理後は細胞を速やかに固定し、より強力な透過処理条件下に置くことで、抗体が核内に侵入し、破壊した分子複合体内のエピトープに到達できるようにしなければなりません。

細胞を固定・透過処理し（上の図では破線の膜で示しています）、染色して、フローサイトメトリーで解析します。サイトカイン産生の研究では、細胞をまずタンパク質輸送阻害薬で処理し、標的タンパク質が細胞内に蓄積するようにします。

BD Biosciences provides tools to support intracellular flow cytometry

細胞内フローサイトメトリーアッセイを容易にするため、BDはいくつかのキット・緩衝液・プロトコルを開発しました。また、時間・サンプル・費用を節約するため、重要な細胞表面マーカーに特異的な多数の蛍光抗体について、いくつかの緩衝液系で試験を行ってきました。緩衝液は、以下の目的のものがあります。

サイトカインの検出

BD Cytofix/Cytoperm™固定・透過処理液（カタログNo.554714）は、大多数のサイトカインや細胞表面マーカーの染色に適しています。この緩衝液系は、一部の転写因子やその他の細胞内タンパク質の染色にも使用できます。この緩衝液系は、刺激の弱い界面活性剤とホルムアルデヒド固定液を含有します。

転写因子

BD Pharmingen™転写因子緩衝液セット（カタログNo. 562574/562725）は、転写因子を単独で、あるいは細胞表面マーカーやサイトカインと併用して染色するためのものです。この緩衝液系は、刺激の弱い界面活性剤とホルムアルデヒド固定液を含有します。

リン酸化タンパク質の検出

BD Phosflow™ 透過処理緩衝液III（カタログNo. 558050）は、フローサイトメトリーでホスホエピトープを検出するのに推奨される透過処理緩衝液です。透過処理緩衝液IIIは刺激性の強いアルコール緩衝液です。特定の実験要件に合う別の透過処理緩衝液もあります。また、便利なbuffer compatibility tool, detailing many common clones and their compatibility with BD Phosflow™ Buffer protocolsも取り揃えています

使用する透過処理法は、細胞表面抗原やその他の細胞内抗原の検出に悪影響を及ぼす可能性があります。核への到達や、DNA-タンパク質複合体やタンパク質-タンパク質複合体の開放を可能にする手法は、多くの場合、細胞表面抗原を変性させ、抗体による細胞表面抗原の検出を妨げる可能性があります。異なる細胞内タンパク質を検出するには、異なる条件が必要となる場合がありますが、基本原理は同じで、細胞を固定・透過処理し、その後に細胞内において蛍光抗体で染色します。

STATホスホチロシンエピトープは活性化細胞内で二量化により不明瞭となります。

最適な細胞透過処理条件はエピトープの位置によって異なります。

Cytokine Detection

サイトカイン検出

さまざまな活性化細胞種が、免疫応答や炎症反応の一環として、サイトカイン、ケモカイン、その他の炎症性メディエーター（パーフォリン、グランザイムなど）を分泌します。

ELISAやBD^®サイトメトリービーズアレイ（CBA）などの手法により、細胞集団全体によって産生された分泌タンパク質を測定できます。一方、細胞内フローサイトメトリーでは、検討対象の細胞集団内における個々の、表現型的に同定される細胞種によって産生されるサイトカインやその他の炎症性メディエーターを解析することができます。

細胞内フローサイトメトリーでは、活性化細胞集団によるサイトカイン産生が、大量のサイトカインを産生している少数の細胞によるものなのか、あるいは細胞当たりのサイトカイン産生量が少量である大規模な細胞集団によるものなのかを容易に特定することができます。さらに細胞内フローサイトメトリーでは、複数のサイトカインを容易に同時測定して多機能性細胞を同定することができます¹。細胞内サイトカイン染色は、B細胞・T細胞の分化や可塑性などのさまざまな研究にも有用です。

サイトカインは、一般的に分泌タンパク質であるため、まずはタンパク質輸送阻害薬を用いて細胞内で捕捉しなければなりません。最も多く用いられているタンパク質輸送阻害薬は、モネンシン（BD GolgiStop™阻害薬）とブレフェルジンA（BD GolgiPlug™阻害薬）の2つです。モネンシンはゴルジ膜貫通Na⁺⁺/H⁺輸送との相互作用によりタンパク質の分泌を阻止しますが、ブレフェルジンAは細胞内で産生されたタンパク質をcis-medialゴルジ複合体から小胞体へと再分配します²。そのため、どちらのタンパク質輸送阻害薬を選択するのが最良であるかはサイトカインや動物種によって異なります（表1）。

Species	Cytokines	Transport Inhibitor
Human	IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α	Monensin
Human	IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-12, MCP-1, MCP-3, MIG, MIP-1α, RANTES	Either Monensin or Brefeldin A
Mouse	IL-6, IL-12, TNF-α	Brefeldin A
Mouse	GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10	Monensin
Mouse	IFN-γ, IL-2	Either Monensin or Brefeldin A

IFN-γ and IL-2 production in CD8+ cells

PBMCs were stimulated with staphylococcal enterotoxin B for 6 hours in the presence of brefeldin A. After stimulation, cells were fixed and permeabilized using the BD Cytofix/Cytoperm™ Buffer System. Cells were stained with the following fluorescent antibodies: CD3 FITC, CD4 PerCP-Cy5.5, CD8 BD Horizon Brilliant Violet™ 421, IFN-γ PE and IL-2 APC. Cells were then washed and analyzed using the BD FACSVerse™ Flow Cytometer.

CD8陽性細胞におけるIFN-γ・IL-2産生

PBMCを、ブレフェルジンAの存在下で、ブドウ球菌エンテロトキシンBで6時間刺激しました。その後、細胞をBD Cytofix/Cytoperm™緩衝液系で固定・透過処理しました。これらの細胞を、蛍光抗体であるCD3 FITC、CD4 PerCP-Cy5.5、CD8 BD Horizon Brilliant Violet™ 421、IFN-γ PE、IL-2 APCで染色しました。その後、細胞を洗浄し、BD FACSVerse™フローサイトメーターにより解析しました。

BD Biosciencesは、蛍光抗体のキット・緩衝液系・豊富なパネルにより、サイトカインや細胞表面マーカーの検出を簡略化しました。表面マーカーに対する抗体や、さまざまな蛍光色素に結合したサイトカインがあります。そのため、染色パネルを柔軟に設計することができ、貴重な細胞サンプルから多くのデータを取得するためのハイコンテントなマルチカラーフローサイトメトリー解析が可能となります。

BD FastImmune™キットには、全血由来サイトカイン産生細胞を最適に調製して染色・検出するための試験済み蛍光抗体カクテル、適切なタンパク質輸送阻害薬、適合する緩衝液、詳細なプロトコルが含まれています。BD FACSVerse™フローサイトメーターシステムに搭載されているアッセイにより、このプロセスがさらに簡略化されます。

BD Cytofix/Cytoperm™緩衝液は、フローサイトメトリーによるサイトカイン産生細胞の解析に関する何千もの文献に引用されています。研究者の間で、検討対象のサイトカインに最も適したタンパク質輸送阻害薬が選択され、BD Cytofix/Cytoperm™緩衝液系を使用してフローサイトメトリー解析のための細胞の固定・透過処理および染色が行われています。

サイトメガロウイルス（CMV）pp65で刺激したCD4陽性CD69陽性Tリンパ球による抗原特異的IFN-γ産生。

References

Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247-258. doi: 10.1038/nri2274
Schuerwegh AJ, Stevens WJ, Bridts CH, De Clerck LS. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factoralpha in monocytes. Cytometry. 2001;46(3):172-176. doi: 10.1002/cyto.1102

Transcription Factors

転写因子

細胞内フローサイトメトリーは、不均一細胞集団内の転写因子や関連タンパク質の検出を可能にします。

複数マーカーの同時解析により、特定の分化経路に沿って移動する細胞の臨界期・マーカー・頻度を特定することができます。

転写因子は、DNAやその他のタンパク質に結合して遺伝子の発現を制御するタンパク質です。転写因子は細胞の発達や分化において重要な役割を担っています。その例として、FoxP3はTregの分化、Sox17は胚体内胚葉の分化に関与しています。

FoxP3はTregsの主要制御因子であると考えられています。多くの転写因子と同様、FoxP3は何千もの遺伝子に結合し、その結果、Tregの機能に必要な遺伝子発現が上方・下方制御されます³。FoxP3により、ゲノムオーガナイザーであるSATB1が抑制され、Tエフェクター細胞によるIL-4やIFN-γなどのサイトカイン産生の誘発が阻止されます⁴。

細胞内フローサイトメトリーによるヒト.

細胞内サイトカイン染色と同様に、フローサイトメトリーによる転写因子の検出には細胞の固定・透過処理が必要となります。転写因子は通常、DNAやその他のタンパク質に結合している核の中に存在します。標的分子エピトープの性質に応じて異なる固定・透過処理緩衝液が必要となる場合があります。

細胞の固定・透過処理により細胞表面マーカー染色が損なわれる可能性があるため、適合する緩衝液を選択することがより一層重要となります。転写因子の検出をさらに容易に行えるようにするため、BD BiosciencesはBD Pharmingen™転写因子緩衝液セットを開発しました。この緩衝液は、核内エピトープが露出するよう十分に細胞を透過処理することができ、数多くの細胞種、細胞表面染色、タンデム色素に適合します。

幹細胞分化の研究に便利なキット

多能性幹細胞はさまざまな細胞種に分化するため、転写因子やその他のタンパク質の発現が変化します。哺乳類の胚発生においては、胚体内胚葉が肝臓・膵臓・腸を発生させます^5-7。胚体内胚葉へと特異化する過程で、転写因子であるSox17およびFoxA2と、細胞表面マーカーであるCD184（CXCR4）の濃度が上昇し、NanogやSox2などの多能性マーカーが減少します⁶。

マルチカラーフローサイトメトリーは、検討対象のマーカーを発現する細胞の相対数を特定するのに優れた手法です。この手法は、細胞分化経路の研究や、特に、さまざまな細胞の分化プロトコルや分化能の最適化・定量化・比較に有用です。

幹細胞内転写因子の研究を容易にするため、BDは、重要な幹細胞特異的転写因子を検出するいくつかのキットを開発しました。これらのキットには、BD Stemflow™ヒト多能性幹細胞転写因子解析キット（カタログNo. 560589）、BD Stemflow™マウス多能性幹細胞転写因子解析キット（カタログNo. 560585）、BD Stemflow™ヒト神経細胞系譜解析キット（カタログNo. 561526）、BD Stemflow™ヒト胚体内胚葉・膵内胚葉解析キット（カタログNo. 562496）などがあります。これらのキットには、多能性幹細胞の特徴を明らかにし、多能性幹細胞がそれぞれの系譜に分化していく過程を追跡するための抗体と緩衝液系が含まれています。

H9 hESCの胚体内胚葉への分化

To facilitate the study of transcription factors in stem cells, BD has developed several kits for the detection of key stem cell–specific transcription factors including the BD Stemflow™ Human Pluripotent Stem Cell Transcription Factor Analysis Kit (Cat. No. 560589), the BD Stemflow™ Mouse Pluripotent Stem Cell Transcription Factor Analysis Kit (Cat. No. 560585), the BD Stemflow™ Human Neural Cell Lineage Analysis Kit (Cat. No. 561526), and the BD Stemflow™ Human Definitive and Pancreatic Endoderm Analysis Kit (Cat. No. 562496). These kits contain antibodies and buffer systems to characterize pluripotent stem cells and track the differentiation of pluripotent stem cells into respective lineages.

References

Birzele F, Fauti T, Stahl H, et al. Next-generation insights into regulatory T cells: expression profiling and FoxP3 occupancy in Human. Nucleic Acids Res. 2011;39(18):7946-7960. doi: 10.1093/nar/gkr444
Beyer M, Thabet Y, Müller RU, et al. Repression of the genome organizer SATB1 in regulatory T cells is required for suppressive function and inhibition of effector differentiation. Nat Immunol. 2011;12(9):898-907. doi: 10.1038/ni.2084
Wang P, McKnight KD, Wong DJ, et al. A molecular signature for purified definitive endoderm guides differentiation and isolation of endoderm from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 2012;21(12):2273-2287. doi: 10.1089/scd.2011.0416
Takayama K, Inamura M, Kawabata K, et al. Efficient and directive generation of two distinct endoderm lineages from human ESCs and iPSCs by differentiation stage-specific SOX17 transduction. PLoS One. 2011;6(7):e21780. doi: 10.1371/journal.pone.0021780
Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 2008;132(4):661-680. doi: 10.1016/j.cell.2008.02.008
D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23(12):1534-1541. doi: 10.1038/nbt1163

Phosphorylation

個々の細胞レベルでデータを収集することができるフローサイトメトリーには、細胞シグナル伝達研究におけるいくつかの利点があります。

溶解物に基づく手法とは異なり、フローサイトメトリーは多種多様なシグナル伝達反応の検出や解析を容易にします。そのため、小規模な細胞集団内における強力なタンパク質リン酸化反応と、より小さいもののより均一である反応とを区別することが可能です。細胞表面マーカーに特異的な蛍光抗体を、全血などの複雑な細胞混合物内の細胞サブセットに添加することで、タンパク質のリン酸化を介するシグナル伝達反応を検出することができます。さらに、細胞を事前に濃縮することなく希少細胞集団を発見することができます。そのため、限られた細胞サンプルから豊富なデータが得られます。

BD Phosflow™製品は、フローサイトメトリーによる細胞内シグナル伝達分子や特異的な翻訳後修飾の検出用に最適化された緩衝液と蛍光モノクローナル抗体から成るシステムで構成されています。フローサイトメトリーで特異的なリン酸化エピトープを検出するには、シグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を維持するために細胞を固定し、その後に透過処理を行って、抗体が細胞に侵入して標的タンパク質に特異的に結合できるようにします。その後、染色細胞のフローサイトメトリー解析により、細胞内シグナル伝達やタンパク質のリン酸化のスナップショットを取得することができます。

タンパク質のリン酸化は、本来、一過性で、タンパク質のホスファターゼによって厳重に制御されています。ウェスタンブロット解析をはじめとする大多数のリン酸化タンパク質検出法では、ホスファターゼを適切なタイミングで刺激して速やかに不活性化することが必要となります。同様に、フローサイトメトリー解析用の細胞サンプルを素早く固定して、ホスホエピトープを維持しなければなりません。また、酸化タンパク質の発現レベルも重要な検討事項です。特定のタンパク質リン酸化イベントは、特に細胞が特定のシグナル伝達タンパク質を低レベルで発現する場合や、検討対象の部位のリン酸化が不完全な場合に、シングルセルレベルでの検出が困難となる可能性があります。BDは、リン酸化タンパク質の細胞内検出を大幅に向上させる明るい蛍光色素に直接結合している高品質の抗体を取り揃えています。

マルチパラメータフローサイトメトリーは、複合混合物中の細胞・細胞サブセットにおける細胞内シグナル伝達の検出や解析において、重要な利点をもたらします。細胞シグナル伝達の研究では、刺激分子や阻害分子で処理したときの細胞の反応を調べることが多いため、非刺激細胞や未処理細胞は多くの場合、バックグラウンド染色について検討する際の最良のコントロールとなります。免疫グロブリンアイソタイプコントロールとは異なり、非刺激細胞コントロールからは、各抗体の特有のバックグラウンド特性や、検討対象細胞内におけるリン酸化タンパク質の基礎発現レベルがわかります。リン酸化エピトープを露出させるには細胞の透過処理が必要です。複数の緩衝液系がありますが、ほとんどの応用例にBD Phosflow™ 透過処理緩衝液IIIが推奨されます。BD Biosciencesのウェブサイトでは、さまざまな緩衝液条件や染色プロトコルの各種のBD細胞表面マーカーや細胞内抗体の性能に関する有益な情報を紹介しています。

一連のBD Phosflow™キットは、適応免疫系や自然免疫系の細胞によって誘発されるシグナル伝達反応の解析に有用なツールです。これらのキットには、特異的白血球サブセットや、重要なリン酸化タンパク質に対する蛍光抗体を同定するための、細胞表面マーカー特異的な蛍光抗体カクテルが含まれています。また、適合する緩衝液、陽性・陰性コントロール細胞、詳細なプロトコルも含まれています。BD Phosflow™ヒトT細胞活性化キット（カタログNo. 560750）はCD4 T細胞とCD8 T細胞のリン酸化タンパク質反応を比較するのに有用です。

Multiplexing

他の手法では、サイトカイン、転写因子、リン酸化タンパク質のいずれかを別々に測定することができますが、細胞内フローサイトメトリーでは、複数の細胞内マーカーをシングルセルレベルで同時に測定することが可能です。

この手法では、シグナル伝達反応、分化の状態、その他の細胞イベントに関するデータが得られます。細胞表面マーカーと細胞内マーカーに特異的な蛍光抗体を組み合わせて使用することで、サンプル間の複数細胞種内における表現型や機能の違いに関する高分解能比較解析が可能となります。

こちらに示す例では、凍結保存PBMCを漸増濃度のヒト組換えIL-2で刺激した後に、細胞表面マーカーと細胞内マーカーで固定・透過処理し、染色しました。BD Pharmingen™転写因子ホスホ緩衝液セットを使用することで、本来であれば困難な、IL-2に対する反応としての制御性T細胞におけるリン酸化STAT5と転写因子FoxP3の同時検出が可能となりました。

T細胞subsetsにおけるIL-2の用量反応。

同一サンプル内の細胞による複数の転写因子・サイトカイン・表面マーカーの発現レベルの同時測定は、Tヘルパー（Th）細胞の分化や機能の研究に非常に役立ちます。RORγtは、Th17細胞の特徴的な転写因子です。RORγtは、IL-17分泌や、CD4陽性CD8陽性二重陽性胸腺細胞の維持において重要です^1,2。

こちらに示す実験結果では、BALB/cマウス胸腺および脾臓から細胞を分離しました。胸腺細胞または脾細胞を、CD44、CD62L、CD196に特異的な蛍光抗体か、適切な免疫グロブリンアイソタイプコントロールのいずれかで表面染色しました。これらの細胞をBD Pharmingen™転写因子緩衝液セットで固定・透過処理し、その後、RORγt、Foxp3、IL-17A、IFN-γに特異的な蛍光抗体で細胞内染色しました。

上のパネルでは、これらの細胞によるIL-17A発現を、RORγt、Foxp3（Treg転写因子）、IFN-γ（Th1サイトカイン）の発現と比較しています。胸腺細胞において予測したとおり、IL-17A陽性RORγt陽性二重陽性細胞は多数認められましたが、IL-17AとFoxp3またはIFN-γの共発現はほとんど認められませんでした。脾細胞はIL-17Aをほとんど発現しませんでした。

下のパネルでは、さらなる解析の結果、脾臓由来のIL-17A産生細胞が細胞表面マーカーであるCD44とCD196（CCR6）を発現したもののCD62Lは発現しなかったことが明らかとなり、IL-17A陽性細胞の表現型に関する追加的な情報が得られました。

BALB/c胸腺・脾臓由来Th17細胞の表現型解析

References

Ghoreschi K, Laurence A, Yang XP, Hirahara K, O’Shea JJ. T helper 17 cell heterogeneity and pathogenicity in autoimmune disease. Trends Immunol. 2011;32(9):395-401. doi: 10.1016/j.it.2011.06.007
Ivanov II, McKenzie BS, Zhou L, et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 2006;126(6):1121-1133. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.035