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Overview
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マルチカラーフローサイトメトリーは、ヘテロな細胞集団からターゲットの細胞集団の迅速な多次元でに解析を提供します。そのアプリケーションには、免疫学、免疫腫瘍学、ウイルス学、免疫モニタリングなどが含まれます。BD Biosciencesは、パネル設計の柔軟性と結合抗体の包括的なポートフォリオを提供するために、すべてのレーザーラインにわたって革新的な色素を開発し、表面、細胞内、または分泌マーカーの詳細な特性評価を支援しています。単純な研究アプリケーションから複雑な研究アプリケーション向けのフローサイトメーターやソーターから、試薬の幅広い選択、学習のためのコンテンツ 、 ツール 、 プロトコール ,プロトコルの包括的なコレクションまで、マルチカラーフローサイトメトリーワークフローの旅を効率的にナビゲートするお手伝いをします。

 

 

マルチカラーフローサイトメトリーの原理

フローサイトメトリーは、細胞ごとに細胞集団を分析します。これは、病状または生物学的プロセスを研究するため、サンプル内の多くの細胞の中からごく少数の細胞を探している今日の研究者や臨床医にとって重要な機能です(like finding needles in a haystack)。第二に、フローサイトメトリーは非常に高速です。日常的なサンプル分析速度は、1秒あたり最大10,000細胞を解析できます。これは、細胞を視覚的に検査およびカウントする従来の方法を超える驚くべき進歩です。最後に、フローサイトメトリーには、単一細胞の複数のパラメーター(多重化)を同時に測定する機能があります。マルチプレックスにより、研究者や臨床医は、これまでになく迅速に単一のサンプルからより多くの情報を収集できます。これらの機能により、フローサイトメトリーは、研究者や臨床医向けの複数のアプリケーションを備えた強力なツールになっています。

フローサイトメーターは、どのようにして細胞を解析しているか?

フローサイトメーターには、流体工学、光学、電子機器の3つの主要なシステムが含まれています。流体工学システムは、細胞のサンプル(例えば、ヒトの血液のサンプル)を単一の流れに注ぎ込み、細胞が一度に1つずつレーザービームを通過するようにする。各セルがビームを通過すると、光を散乱させ、蛍光を発する場合があります。これらの光信号は光学システムによって収集され、さまざまな検出器に送られます。検出器が受信した信号は、電子システムによって数値に変換されます。結果は画面に表示したり、特別に設計されたソフトウェアを使用して将来の分析のために保存したりできます。各セルがビームを通過すると、そのパラメータ(特性)が測定され、ビームを通過した時間とともに記録されます。通常、データはサンプルごとに少なくとも10,000細胞の情報を保存します。

 
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ソーティング

まず最初に、フローサイトメーターが目的の細胞を識別できるようにパラメーターを設定します。サンプルを含む流体の流れは、流体工学システムによって高圧で単一の流れに注ぎ込まれ、細胞がレーザービームを一度に1つずつ通過し、そこで細胞に関する情報が検出されます。細胞が指定されたパラメータに一致する場合、サイトメーターはそれに電荷をかけます。これにより、帯電したセルが収集チューブに向かって偏向します。その後、研究者は目的の細胞を取り出して培養で増殖させたり、他のアッセイで研究したりすることができます。帯電していない液滴は、ストリーム内で廃棄されます。このプロセスは迅速で、毎秒最大20,000セルの速度で実行できます。

 

実験に最適なセルソーターを見つけてください。BD Biosciencesは、シンプルなベンチトップシステムから高度で完全に構成可能なシステムまで、さまざまな研究アプリケーション向けのさまざまな研究用のセルソーター を提供しています。

 

細胞の検出、解析方法

細胞がレーザービームを通過すると、光はさまざまな方向に散乱します。光がどの程度、どの方向に散乱するかを測定することは、細胞のサイズと内部の複雑さの両方を判断するのに役立ちます。フローサイトメトリーを使用すると、一度に複数の細胞集団を研究でき、サイズや複雑さを超えた情報を取得できます。

 

細胞がもつマーカーを特定するための蛍光色素の検出

モノクローナル抗体は、レーザーで励起されると蛍光を発する蛍光色素(蛍光色素)に結合していることがよくあります。蛍光色素により、抗体またはマーカーに結合した細胞を追跡できます。ほとんどの細胞は自然に蛍光灯を発しません。ただし、蛍光色素タグ付きモノクローナル抗体が細胞に存在する抗原に結合している場合、その細胞がフローサイトメーターのレーザービームを通過するときに蛍光シグナルが検出されます。

 
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蛍光色素は、放出する光の色が互いに異なります。たとえば、BDが提供する蛍光色素の1つであるFITCは緑色の光を発しますが、BDが提供する別の蛍光色素の1つであるPEは、フローサイトメーターで使用されるレーザーにさらされるとオレンジ色の光を発します。異なる蛍光色素の使用は、研究者が細胞集団または異なる細胞活動を区別するのに役立ちます。

Fluorescence as a marker of cells and cellular activities

 

Fluorochrome Em-Max (nm)
BD Horizon™ BUV395 395
BD Horizon™ BV421 423
BD Horizon™ V450 450
BD Pharmingen™ Pacific Blue™ 455
BD Horizon™ BV480 479
BD Horizon™ BUV496 496
BD Horizon™ V500 499
BD Horizon™ BV510 512
BD Horizon™ BB515 515
Alexa Fluor™ 488 517
BD Pharmingen™ FITC 518
BD Horizon™ BUV563 564
BD Horizon™ BV570 573
BD Pharmingen™ PE 576
BD Horizon™ BYG584-P 583
BD Horizon™ BV605 605
BD Horizon™ BB630-P2 614
BD Horizon™ BUV615 615
BD Horizon™ PE-CF594 615
BD Horizon™ BV650 649
BD Horizon™ BUV661 660
Fluorochrome Em-Max (nm)
BD Horizon™ BB660-P2 660
BD Pharmingen™ APC 660
BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 647 669
BD Pharmingen™ PE-Cy5 670
BD Pharmingen™ PerCP 675
BD Pharmingen™ PerCP-Cy5.5 676
BD Horizon™ BB700 695
BD Horizon™ APC-R700 706
BD Horizon™ BV711 713
BD Horizon™ Red 718 718
BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 700 719
BD Horizon™ BUV737 735
BD Horizon™ BV750 754
BD Horizon™ BB755-P 755
BD Pharmingen™ APC-Cy7 779
BD Pharmingen™ PE-Cy7 781
BD Pharmingen™ APC-H7 782
BD Horizon™ BV786 786
BD Horizon™ BB790-P 790
BD Horizon™ BUV805 803

BUV, BD Horizon Brilliant™ UV; BV, BD Horizon Brilliant Violet™; BB, BD Horizon Brilliant™ Blue; BYG, BD Horizon Brilliant™ Yellow-Green; -P, prototype dyes.

マルチカラーフローサイトメトリー

さまざまな種類の細胞は、さまざまな抗原の組み合わせを持ち、さまざまな抗体の組み合わせと結合します。細胞のサンプルのテストに使用される各モノクローナル抗体が異なる蛍光色素にリンクされている場合、細胞の種類は、レーザービームを通過するときに放出される色の組み合わせによって互いに区別できます。

 

複数の蛍光色素の組み合わせを同時に使用すると、細胞の異なる集団を区別する能力がさらに向上します。次の図は、Tリンパ球を探すために細胞サンプルをテストする際に、それぞれが異なる蛍光色素にリンクされた2つの異なるモノクローナル抗体が使用された例を示しています。4つの異なるタイプの細胞が明らかでした。

 

フローサイトメトリーは、蛍光技術の柔軟性と迅速性を持ち合わせています。これは細胞分析のゴールドスタンダードになり、現在、ライフサイエンスの多くの分野で分析ツールとして使用されています。.

 
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フローサイトメトリーにおける細胞内解析

細胞内フローサイトメトリーは、細胞の種類を特定し、細胞株および異種細胞サンプル内のシグナル伝達および機能的応答を分析するための強力な手法です。BD Biosciencesは、細胞内フローサイトメトリーを容易にするためのさまざまな試薬、キット、およびプロトコルを提供しています。細胞内サイトカイン染色、リンタンパク質、細胞内フローサイトメトリーによる転写因子検出をサポートするBD蛍光色素標識抗体、バッファー、キット、プロトコール などのツールとテクニックを見つけてください。

Multicolor Flow Cytometry Tools
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マルチカラーフローサイトメトリーのためのBD Biosciences ツール

フローサイトメーター

フローサイトメトリーのパイオニアとして、私たちはフローサイトメトリー機器開発の最前線に立ってきました。私たちはあなたの研究をサポートするための、セルアナライザー  とセルソーター を実験に応じて選択できるよう幅広ラインナップを提供します。

 

レーザーと蛍光色素

レーザーは、細胞のサイズと細胞内の構造の対する複雑さに関する情報を提供し、細胞の機能の識別と理解を可能にする抗原特異的抗体に結合した蛍光色素を励起します。マルチカラーフローサイトメトリーの能力を十分に活用するには、使用する蛍光色素を理解し、さまざまな蛍光色素のスペクトル特性を比較し、分析する必要のあるパラメーターの数に基づいて適切な機器を決定することが重要です。マルチカラーフローサイトメトリー用に、すべてのレーザーラインで多種多様な蛍光色素を提供しています。実験に適した蛍光色素を選択できるように、励起/発光スペクトル、フィルターの推奨事項、相対分解能情報などの属性を持つ色素を表示および比較できる蛍光色素アトラスを開発しました。

 

BD OptiBuild™ オンデマンド試薬

BD OptiBuild™オンデマンド試薬を使用すると、増え続ける色素の組み合わせのカタログで必要な抗体に簡単にアクセスできます。BD OptiBuild™試薬は、新しい蛍光色素を評価および追加し、パネル設計を簡素化する柔軟性を提供します。

プロトコールと関連資料

プロトコール 

実験に適したプロトコールを見つけるために、protocol repository. を開発しました。ここでは、フローサイトメトリーワークフローをサポートするためのステップバイステップガイド、役立つ実験例、およびその他のリソースを見つけることができます。

 

パネルデザインのための資料とツール

マルチカラーパネルデザインのためのツール、関連資料 を用意しています。ご活用ください。

BD Horizon Brilliant™ Polymer Dyes
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BD Horizon Brilliant™ 色素

BD Horizon Brilliant™ 色素は、Sirigen Ltdの駆的なポリマー染料技術から開発されました。これらのユニークな色素は、従来の色素よりも明るい、画期的な製品です。

 

表面に受容体がほとんどない細胞の場合、サンプル内の他の細胞からこれらの薄暗い細胞を分離するには、明るい試薬が不可欠です。BD HorizonBrilliant™ポリマー色素の特性により、場合によっては、従来の有機蛍光色素やPEやAPCなどのフィコビリタンパク質よりもはるかに明るい蛍光シグナルを実現できます。これは、以前に可能であったよりも広い範囲の受容体密度を持つ細胞集団を識別するのに効果的であることを意味します。

 

BD Horizon Brilliant™ 色素の優れたテクノロジー

2000年には、電子およびディスプレイ業界に革命をもたらしている独自のクラスの導電性高分子材料の発見により、ノーベル化学賞が授与されました。BD Horizon Brilliant™色素は、これらの特許取得済みの化学物質に基づいており、励起光を収集し、それをより長い波長の放出光に効率的に変換するのに効果的な非常に光安定性のポリマーベースの色素の作成を可能にします。

 

これらの優れたポリマーレポーターは、さまざまなアッセイやアプリケーションで使用するために、核酸プローブや抗体に取り付けることができます。それらは感度のために検出信号を劇的に(最大100倍)増加させることができます。

シグナルの増幅

BD Horizon Brilliant™染料ポリマー鎖は、光学セグメントの集合体と見なすことができます。ポリマー鎖の各セグメントは光を吸収することができるため、非常に大きな吸光係数(または光の光子を吸収する確率)を持つことができます。

 

これらの材料に固有の電子非局在化の結果として、エネルギーはこれらの拡張されたチェーンに沿って移動または移動する能力を持っています。したがって、ポリマーによって収集されたすべての光は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)プロセスを通じて、密接に関連する低エネルギーの蛍光アクセプターに送られるか、染料が使用されていない場合はポリマー自体によって蛍光として放出されます。

 

レポーター色素と結合したこれらのポリマーは、例外的なストークスシフトを伴うタンデム色素を作成するためのドナーとしても機能します。

 
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ベースポリマー色素とタンデム色素

BD Horizon Brilliant™ 色素は、ベースポリマー色素とタンデム色素の2種類を持っています。

 

 ベースポリマー色素は、この技術の最も単純な実施形態であり、非常に光安定性があり、従来の蛍光色素と比較して明るい。それらは、励起光(分子アンテナのような)を収集し、それをより長い波長の放出光に効率的に変換するのに非常に効果的です。

 

ポリマータンデム色素は、2つの色素分子で構成されています。ベースポリマー(ドナー)色素と2番目の従来の蛍光(アクセプター)色素です。分子は化学的に結合して、ドナーの励起波長で励起され、アクセプターの発光波長で発光するタンデム色素を形成します。これらのタンデム染料は、従来のタンデム染料と比較して非常に明るいです。

 

この技術の将来の目標の1つは、マルチカラーフローサイトメトリーを容易にするために簡単に多重化できるベースポリマー色素とポリマータンデム色素を設計することです

 

測定例

 

View data from our newest BD Horizon Brilliant™ Dyes.

For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.

Alexa Fluor and Pacific Blue are trademarks of Life Technologies Corporation. 

Cy is a trademark of Global Life Sciences Solutions Germany GmbH or an affiliate doing business as Cytiva.