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免疫肿瘤学(IO)的重点是利用免疫系统诱发适当的抗肿瘤反应,阻止癌症的恶化。免疫系统具有天然的防御机制,可以防止病原体入侵。免疫检查点,如细胞程序性死亡蛋白-1(PD-1)和CTLA-4,是机体内防止自身免疫细胞攻击的制衡系统的一个必备组成部分。这种区分自体与异体的能力对于防止发生不受控制的免疫应答来说至关重要。然而,癌细胞和肿瘤微环境可以通过这些免疫检查点来伪装成“自体”分子,避开人体自身免疫系统的自然防御。肿瘤细胞可以在其表面表达PD-1配体(PD-L1)与PD-1结合,激活免疫系统的这种开关。免疫肿瘤学方法包括使用抑制剂(如抗PD-1/PD-L1药物)阻断PD-1/PD-L1相互作用,并促使免疫系统识别出肿瘤细胞,阻断它们对免疫检查点蛋白的操纵。1 最近人们已经开始将免疫治疗与手术、放化疗等其他标准治疗方案相结合进行肿瘤治疗了。

 
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肿瘤微环境

由血管、淋巴管、间充质细胞、免疫细胞等构成的肿瘤微环境(TME),是影响肿瘤恶化和治疗效果的主要因素。肿瘤微环境的特性与对高浸润细胞毒性T细胞治疗的反应或耐受有关,因此这些T细胞能够支持更好的免疫应答来攻击肿瘤细胞。2 肿瘤微环境的调节也是一种用于肿瘤抑制的策略。在临床试验中,T细胞靶向免疫调节剂(如抗PD-1或CTLA4的单克隆抗体)通常是与抗多种恶性肿瘤的、经过嵌合抗原受体(CAR)工程设计的T细胞(CAR-T细胞)结合使用。3 第四代CAR经过特殊设计,试图通过激活宿主效应T细胞、压制宿主抑制性T细胞、强化记忆T细胞,进而通过释放细胞因素来调节肿瘤微环境。这些产生细胞因子的CAR被称为“细胞因子普遍杀伤重定向T细胞”(TRUCK),可以通过传递多种细胞因子,如IL-12、IL-15、IL-18或IL-21来控制免疫效应细胞的功能。4

癌症干细胞

癌症由具有不同功能和表型的异质细胞群组成。人们已将一部分具有干细胞特征的癌细胞(即癌症干细胞(CSC))已被归类为几种癌症类型,包括结肠癌、脑癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和血癌。癌症干细胞可以通过高度分化的癌细胞补充肿瘤核心,被认为是传统癌症治疗(如放疗,化疗)耐受以及肿瘤复发的一个根源。一种癌症干细胞比率:有利于癌症干细胞的非癌症干细胞,与预后差相关。5 人们正在将癌症干细胞作为肿瘤治疗的靶点,对其进行积极评估,包括免疫肿瘤治疗方法,如乳腺癌中的抗CD44抗体和STAT3抑制剂VII,抗小细胞肺癌Notch 2/3的Tarexumab,以及抗膀胱癌PI3K/AKT的Myrtucommulone-A和Motesanib。6 根据GLOBOCAN在2018年进行的研究,死亡率最高的肿瘤(如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌)通常具有高度异质性,并会表现出不同程度的干细胞活性。7

参考

  1. Wu X, Gu Z, Chen Y, et al. Application of PD-1 blockade in cancer immunotherapy. Comput Struct Biotechnol J. 2019;17:661-674. doi:10.1016/j.csbj.2019.03.006

  2. Shen R, Li P, Li B, Zhang B, Feng L, Cheng S. Identification of distinct immune subtypes in colorectal cancer based on the stromal compartment. Front Oncol. 2020;9:1497. doi:10.3389/fonc.2019.01497

  3. Feins S, Kong W, Williams EF, Milone MC, Fraietta JA. An introduction to chimeric antigen receptor (CAR) T-cell immunotherapy for human cancer. Am J Hematol. 2019;94(S1):S3-S9. doi: 10.1002/ajh.25418

  4. Knochelmann HM, Smith AS, Dwyer CJ, Wyatt MM, Mehrotra S, Paulos CM. CAR T cells in solid tumors: Blueprints for building effective therapies. Front Immunol. 2018;9:1740. doi: 10.3389/fimmu.2018.01740

  5. Pan Y, Ma S, Cao K, et al. Therapeutic approaches targeting cancer stem cells. J Cancer Res Ther. 2018;14(7):1469-1475. doi:10.4103/jcrt.JCRT_976_17

  6. Shibata M, Hoque MO. Targeting cancer stem cells: a strategy for effective eradication of cancer. Cancers (Basel). 2019;11(5):732. doi:10.3390/cancers11050732

  7. Walcher L, Kistenmacher AK, Suo H, et al. Cancer stem cells-origins and biomarkers: perspectives for targeted personalized therapies. Front Immunol. 2020;11:1280. doi:10.3389/fimmu.2020.01280
Therapy Trials and Targets
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肿瘤免疫治疗试验的类型及其靶点

人们正在积极研究不同类型的免疫肿瘤学(IO)疗法。1 按作用机制(MOA)整理,可以划分六类免疫肿瘤学疗法,包括细胞疗法、癌症疫苗、溶瘤病毒、T细胞靶向免疫调节剂、其他免疫调节剂以及CD3靶向双特异性抗体。1

 

细胞疗法

细胞疗法通过在患者体内转移完整健康的活体细胞,有望治愈或减轻疾病负担。这是一个涉及多种疾病的活跃研究领域。过继细胞疗法(ADC)是免疫肿瘤学界所认可的其中一种细胞疗法。过继细胞疗法或细胞免疫疗法是利用患者自身的免疫细胞来对抗癌症。这些细胞要么在扩增后按原样重新注入患者体内,以增加抗肿瘤免疫细胞的数量,要么被改造成能够更有效识别和清除肿瘤细胞的细胞。过继细胞疗法的实例之一就是CAR-T细胞疗法2

 

癌症疫苗

癌症疫苗包括预防性以及治疗性疫苗。预防性癌症疫苗是给健康人注射的,以防止癌症形成。经批准的治疗性癌症疫苗包括防止最终发展成肝细胞性肝癌(HCC)的乙型肝炎病毒(HBV)疫苗和用于预防宫颈癌的人乳头瘤病毒(HPV)疫苗。治疗性癌症疫苗可增强患者免疫系统对抗癌症的能力,给癌症患者注射后,可根除已经形成的癌症。

 

溶瘤病毒

溶瘤病毒作为癌症免疫疗法,利用了一些公认的、能够诱导免疫原性细胞死亡的病毒。这种疗法会暴露多种躲避免疫检测的肿瘤相关抗原。然后,这些病毒可以借助经活化的成熟树突状细胞进入免疫系统。当病毒基因组数目较多时,会通过损伤相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)受体的免疫危险信号被激活。这种激活状态会使适应性免疫系统(包括细胞毒性CD8+T细胞和辅助性CD4+T细胞)重新将肿瘤当作靶点,从而解除局部免疫抑制。

 

T细胞靶向免疫调节剂

利用T细胞靶向免疫调节剂的疗法包括抗PD-1或CTLA4的单克隆抗体,以及将一些共刺激分子作为靶点的一些新出现的免疫疗法,包括4-1BB和OX40。

 

检查点阻断疗法可以抑制同源受体与其配体之间的相互作用。此类疗法包括抗体药物结合物、细胞因子治疗、肿瘤特异性T细胞以及树突状细胞疫苗。

 

作用于其他免疫细胞或肿瘤微环境的免疫调节剂

有证据表明,除了T细胞外,人们也在探索将NK细胞用于细胞疗法的潜力。HLA-I水平的下调可以通过一种“丧失自我”识别机制诱导NK细胞介导的杀伤。3抑制机制包括杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)和CD94/NKG2A,可识别主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子。

 

其他免疫调节剂,包括抗Toll样受体(TLR)或干扰素-α/β受体1(IFNAR1)的激动剂,也在积极研究之中。

 

CD3靶向双特异性抗体

CD3靶向双特异性抗体(例如Blinatumomab)用于重定向原初T细胞,并诱导靶细胞特异性裂解。 

参考

  1. Tang J, Shalabi A, Hubbard-Lucey VM. Comprehensive analysis of the clinical immuno-oncology landscape. Ann Oncol. 2018;29(1):84-91. doi:10.1093/annonc/mdx755

  2. Maus MV, June CH. Making better chimeric antigen receptors for adoptive T-cell therapy. Clin Cancer Res. 2016;22(8):1875-1884. doi:10.1158/1078-0432.CCR-15-1433

  3. Minetto P, Guolo F, Pesce S, et al. Harnessing NK cells for cancer treatment. Front Immunol. 2019;10:2836. 10.3389/fimmu.2019.02836
BD Solutions and Resources
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BD Biosciences能够为您的免疫肿瘤学研究工作流程提供全面的解决方案

 

从标本采集到样本制备再到细胞分析,BD Biosciences为免疫肿瘤学研究提供了多种工具。

样本采集

BD Vacutainer®系列产品可用于保存血细胞和生物标记物。

 

样本制备工具

BD Horizon™ Dri Tumor and Tissue Dissociation Reagent (TTDR) 能够实现温和、有效的解离,同时还能保存良好的抗原表位。TTDR可实现细胞产量最大化,同时还能尽量减少细胞死亡数量,从而可以对多种类型的肿瘤类型进行有效解离,便于进行单细胞研究。

 

BD或外部研究者评估的肿瘤类型包括肺部、乳腺、结肠肿瘤、淋巴瘤、黑色素瘤/皮肤肿瘤、胰腺、食管、肾脏肿瘤、肉瘤以及脑瘤。

 

 
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  • 标记 Pop Si MFI %阳性
    cd1a        
    cd1b        
    cd1d 5      
    CD2 4      
    CD3 4      
    CD4 4      
    CD4v4 4      
    CD5 5      
    CD6 4      
    CD7 4      
    CD8a 4      
    CD8b 4      
    CD9 4      
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    CD11a 4      
    CD11b 6      
    CD11c 6      
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    CD21        
    CD22        
    CD23        
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    CD25 4      
    CD26 4      
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    CD29 4      
    标记 Pop Si MFI %阳性
    CD30 4      
    CD31 5      
    CD32 6      
    CD33 5      
    CD34        
    CD35 6      
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    CD38 5      
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    CD40 1      
    CD43 4      
    CD44 6      
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    CD45RA 3      
    CD45RB 3      
    CD45RO 6      
    CD46 1      
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    CD49a 2      
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    CD49d 4      
    CD49e 2      
    CD50 6      
    CD51/61 5      
    CD53 6      
    CD54 2      
    CD55 6      
    CD56 3      
    CD57 3      
    CD58 4      
    CD59 1      
    标记 Pop Si MFI %阳性
    CD61 5      
    CD62E        
    CD62L 4      
    CD62P        
    CD63 2      
    CD64 5      
    CD66(a-e) 6      
    CD66b 6      
    CD66f        
    CD69 5      
    CD70 5      
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    CD72        
    CD73 2      
    CD74 5      
    CD75        
    CD77        
    CD79b        
    CD80        
    CD81 4      
    CD83 5      
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    CD85 5      
    CD86 5      
    CD87 6      
    CD88 6      
    CD89 5      
    CD90        
    CD91 5      
    CDv93 6      
    CD94 9      
    CD95 5      
    CD97 5      
    CD98 5      

     

    标记 Pop Si MFI %阳性
    CD99 5      
    CD99R        
    CD100        
    CD102 5      
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    CD108 5      
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    CD112        
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    CD117        
    CD118 2      
    CD119 5      
    CD120a 5      
    CD121a 2      
    CD121b 5      
    CD122 3      
    CD123 2      
    CD124 5      
    CD126        
    CD127 4      
    CD128b 5      
    CD130 5      
    CD134        
    CD135        
    CD137 5      
    CD137L        
    CD138        
    CD140a 2      
    CD140b 2      
    标记 Pop Si MFI %阳性
    CD141 1      
    CD142 1      
    CD144        
    CD146 2      
    CD147 1      
    CD150 4      
    CD151 1      
    CD152 2      
    CD153 5      
    CD154        
    CD158a 3      
    CD158b 9      
    CD161 9      
    CD162 5      
    CD163 5      
    CD164 5      
    CD165 5      
    CD166 5      
    CD171 5      
    CD172b 5      
    CD177 7      
    CD178        
    CD180 5      
    CD181 6      
    CD183 4      
    CD184 5      
    CD193        
    CD195 5      
    CD196        
    CD197        
    CD200        
    CD205 5      
    CD206 5      
    CD209 5      
    标记 Pop Si MFI %阳性
    CD220 5      
    CD221 1      
    CD226 4      
    CD227 5      
    CD229 4      
    CD231 1      
    CD235a        
    CD243        
    CD244 5      
    CD255 5      
    CD268 3      
    CD271 1      
    CD273        
    CD274 2      
    CD275 5      
    CD278        
    CD279        
    CD282 5      
    CD305 5      
    CD309        
    CD314 4      
    CD321 5      
    CDw327 3      
    CDw328 5      
    CD329 5      
    CD335 3      
    CD336        
    CD337 3      
    CD338 5      
    CD340 1      
    ebTCR 4      
    b2-microglobulin 4      
    BETR-1 6      
    CLIP 3      

     

     

    标记 Pop Si MFI %阳性
    EGF Receptor 1      
    fMLP Receptor 5      
    gdTCR 4      
    HPC        
    HLA-A,B,C 5      
    HLA-A2 5      
    HLA-DQ 5      
    HLA-DR 5      
    HLA-DR,DP,DQ 5      
    Invariant NK T        
    DGD2 5      
    MIC A/B 5      
    NKB1        
    SSEA-1 6      
    SSEA-4 2      
    TRA-1-60 3      
    TR-1-81        
    Vb23        
    Vb8        
    CD326 1      
    CD49f 1      
    CD104 1      
    CD120b 5      
    CD132 5      
    CD201 1      
    CD210 5      
    CD212        
    CD267 5      
    CD294 6      
    CLA 6      
    Integrin b7 10      

     

    细胞表面抗原表位的保存。A. 对所有10个不同细胞群的BD目录进行表面标记物表达评估。表达率低于20%的标记物用灰色框表示。针对每个标记物,选择单个细胞群(T细胞、非T细胞)进行分析。使用染色指数(SI)、阳性信号的平均荧光强度(MFI)以及对给定标记物呈现明显阳性的细胞群百分比(%pos)比较未处理与经处理(暴露于酶)样本。亮蓝色表示变化小于15%,浅蓝色表示变化在16%–30%之间,深蓝色表示变化在30%或以上。

     

 

从图中可看出,大多数标记物保留了采用平均荧光强度和染色指数测定的表位,解离后的变化小于0-30%。

 

细胞染色、表征及分析工具

BD Biosciences提供了超过9,000种专为实现有效细胞表征而设计的免疫学和免疫肿瘤学相关试剂

 

BD Horizon™ Dri  流式方案的干试混合剂为预先设计,可以使用多色流式方案优化并测试记忆T细胞、单核细胞亚群和TBNK细胞特性。

 

除了预先设计的检测组套之外,我们的定制解决方案还提供冻干、液体或干燥样式的多色检测组套的承包制造,以最大限度地减少与人工混合试剂相关的误差以及时间耗费,提高试剂稳定性,并显著提高性能一致性。

 

BD Horizon Brilliant™ Polymer Dyes是从先进的Sirigen染料技术发展而来的,能够进行高参数流式细胞技术实验,识别细胞群。明亮的染料有助于区分暗淡的细胞群,例如样本中受肿瘤浸润的淋巴细胞或表面受体很少的其他细胞。

 

 

BD Horizon™ Dri Monoset 组合

 

荧光染料 标记 克隆
FITC CD16 3G8
PE HLA-DR L243
PerCP CD14 MΦP9
APC CD192 (CCR2) LS132.1D9

 

BD Horizon™ Dri Memory T细胞组合

 

荧光染料 标记 克隆
FITC CD197 150503
PE-Cy7 CD95 DX2
BD Horizon™ APC-R700 CD27 M-T271
APC-H7 CD3 SK7
BD Horizon™ V450 CD4 SK3
BD Horizon™ V500-C CD8 SK1
BD Horizon Brilliant™ Violet 605 CD45RA HI100

 

BD Horizon™ Dri TBNK+CD20 试剂组合

 

荧光染料 标记 克隆
BD Horizon Brilliant™ Violet 450 CD20 L27
FITC CD95 DX2
PE CD16 B73.1
PE CD56 NCAM16.2
PerCP-Cy5.5 CD45 2D1 (Hle-1)
APC CD19 SJ25C1
PE-Cy7 CD4 SK3
APC-Cy7 CD8 SK1

 

细胞分选仪

BD FACSMelody™ Cell Sorter 能够实现简单、快速、优质的细胞分选,是富集稀有细胞群时的理想选择。

 

造血干细胞和造血祖细胞的荧光活化细胞分选,可用于下游单细胞多组学分析,以研究受肿瘤驱动的造血微扰。

 

从健康和荷瘤小鼠体内解离的造血干细胞和祖细胞,可用于下游单细胞多组学分析。

C57BL/6小鼠皮下注射B16-F10黑色素瘤细胞(荷瘤小鼠,n=4)或对照培养基(健康小鼠,n=4)。21天后取骨髓和脾组织。使用BD IMag™ Mouse Hematopoietic Progenitor (Stem) Cell Enrichment Set对健康或荷瘤小鼠的骨髓及脾细胞进行机械分离并完成富集。

 

 
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用表中列出的抗体-荧光色素结合物对细胞进行染色。使用BD FACSMelody™ Cell Sorter获取、解离造血干细胞及祖细胞。首先对细胞进行圈门,以收集特定谱系的阴性活体细胞,然后进行双重细胞识别(图中未标示)。在CD127细胞群中,LSK造血干细胞圈门为Lin-Sca1+cKit+。造血祖细胞群:在Sca1-cKit+门内根据CD34 v CD16/CD32的表达对MEP(巨核红细胞祖细胞)、CMP(普通髓系祖细胞)以及GMP(粒细胞-巨噬细胞祖细胞)进行鉴定。BD FACSChorus™ Acquisition Software生成的伪彩色等值线图分别对应于从健康骨髓(A)、荷瘤骨髓(B)、荷瘤脾组织(C)中分选LSK、MEP、CMP以及GMP细胞的策略。分选出的细胞用于下游单细胞多组学分析。(D) 所示为圈门及分选策略的群落层级。(E) 使用BD FACSMelody™ Cell Sorter对健康小鼠骨髓分选细胞进行分析,进行纯度检查。同时从健康骨髓样本中解离出了四个细胞群(LSK、MEP、CMP及GMP),各自纯度如伪彩色等高线图所示。同时还给出了亲代细胞的百分比统计数据。

 

细胞分析仪

BD FACSCelesta™ Flow Cytometer 可以对耗竭性T细胞进行全面的免疫表型分析。.

 

抑制性受体在未受刺激及受体外刺激的CD8+和CD4+ T细胞中的共表达模式。采用双变量图,不仅可以实现抑制性受体复杂共表达模式的鉴定,还能突出显示受体外持续刺激的T细胞的异质表型以及耗竭性T细胞的免疫表型分析结果。通过分析散点图分析,在新鲜、未受刺激的外周血单个核细胞(PBMC)及T细胞(使用Dynabeads® Human Activator CD3/CD28及人重组IL-2在体外持续刺激9天)中识别出共表达抑制性受体的CD8+ T细胞与CD4+细胞亚群。

 
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A. 双变量图分析给出了共表达抑制性受体的CD8+ T细胞异质性的信息。例如,可以检测到仅表达TIGIT、仅表达PD-1或同时表达两种抑制性受体的不同细胞亚群。B. 在体外持续刺激后,观察到了导致受试抑制性受体出现差异性调节的、更为复杂的表达模式。例如,虽然CD8+ TIGIT+ 细胞的总百分比降低,但同时观察到PD-1和TIGIT共同表达的细胞增加。有趣的是,只有一小部分CD8+细胞上调了CTLA-4的表达,从而证实了受持续刺激的细胞的异质性。(C–D)对CD4+ T细胞亚群进行了类似的观察。

 

BD FACSLyric™ Flow Cytometry System 有助于确保再现性及实现标准化。BD FACSLyric™ Flow Cytometry System解决方案具备简便、迅速、自动化的特点,能够简化工作流程,提高生产效率。这种新一代流式细胞仪能够保障结果的一致性以及测定方法的可移植性,因此能够为标准化及协同工作提供全面支持。

 
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使用BD FACSLyric™ Analyzer证明活化T细胞上的免疫检查点受体表达部分会受到培养时间或刺激条件的调节。中等浓度(50ng/mL)的PMA加上离子霉素可诱导CD3+T细胞中CD134、CD137、PD-L1/CD274、HLA-DR、CD86、CD152以及PD-1/CD279的强力上调。

 

 

采用BD FACSLyric™ Flow Cytometer及10色测定法,检测外周血免疫细胞上免疫检查点受体的表达。

 

靶抗原 替代名称 克隆 荧光团 目录号
CD45 PTPRC 2D1 APC-H7 560178
CD3 n/a SK7 PerCP-Cy 5.5 340949
HLA-DR n/a G46-6 BD Horizon™ BV510 563083
CD28 n/a CD28.2 PE-Cy 7 560684
CD134 0X40 ACT35 PE 555838
CD137 4-1BB 4B4-1 APC 550890
CD274 PD-L1 M1H1 FITC 558065
CD86 B7-2 2331 Alexa Fluor™ 700 561124
CD152 CTLA-4 BN13 BD Horizon™ BV421 562743
CD279 PD-1 EH12.1 BD Horizon™ BV605 563245

 

多组学

BD提供了各种各样的多组学解决方案,能够帮您全面提升研究能力、简化研究过程。  BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System 结合 BD® AbSeq Oligonucleotides 可作为单细胞工作流程综合解决方案,帮您全面提升自己的研究实验能力。BD® AbSeq Oligonucleotides能够支持各种高参数流式细胞分析术,便于将分析结果转移到检测组套设计之中,也便于将WTA分析结果转移到靶向检测组套。

 

使用BD® AbSeq Oligonucleotides表征CAR CD19 T细胞澳大利亚悉尼Westmead Hospital医院一项临床试验的参与者,使用基于4-1BB共同受体(而非CD28)以及piggyBAC系统的CAR T细胞进行基因修饰。采用单细胞多组学方法研究了输注前产品和过继移植患者血液中CAR T细胞的分子、功能和转录组学图谱。

 
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这是为了验证CAR T细胞输注后存活是由长期干细胞样记忆T细胞(TSCM)驱动的假说。干细胞样记忆T细胞被认为是CAR T细胞产物中一个较小的亚群,在CAR T细胞输注后100天内,发现这些细胞在患者血液中出现了扩增(图中未给出相关数据)。

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BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System 支持高通量单细胞多组学分析,该系统包括:具质量监控功能的微孔式仪器平台;一系列RNA及蛋白质测定工具,如全转录组测定、  靶向RNA panels 以及 TCR/BCR 图谱测定; BD® AbSeq Antibody-Oligo’s; 以及软件工具。 BD Rhapsody™ System 可以与其他上游BD细胞富集技术(如荧光激活细胞分选)无缝结合,使用户能够深入研究自己感兴趣的细胞。BD Rhapsody™ System适于多种单细胞的多组学应用,包括免疫肿瘤学研究

 
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信息学

BD提供了多种功能强大的软件应用程序,包括 FlowJo™ 以及 SeqGeq™ Software, 能够帮助您快速、轻松地分析数据。FlowJo™ Software是业内领先的单细胞流式细胞分析平台(最新版本FlowJo™ v10.6),可以帮您将自己的分析能力提高到一个全新的层次,其新功能包括光谱补偿、动态叠加、BD FACSDiva™ Software支持改进等。SeqGeq™ v1.6 Software作为桌面生物信息学平台,可以通过直观的界面实现复杂的scRNA-Seq单细胞测序分析。通过不断探索,充分利用交互式图形帮您实现下一代测序工具的可视化、简化测序工作,节约您的时间。 

 
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仅供研究使用。不用于诊疗程序。

BD流式细胞仪是1类激光产品。

 

BD FACSLyric™ Flow Cytometer仅供研究使用,且仅限结合BD FACSuite™ Application使用,最多12色。不能于诊疗程序。