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A series of test tubes in a laboratory.

CD56 (NCAM)

CD56也称为神经细胞粘附分子1(NCAM-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)或胚胎型NCAM(E-NCAM)。1其为免疫球蛋白超家族的成员,几乎在所有组织中均有表达。根据细胞类型,通过单个基因NCAM1的可变剪接生成三种主要亚型(NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180)2 BD提供多种在人、非人灵长类动物以及小鼠靶标中检测CD56的抗CD56泛抗体克隆。 

CD56生物学
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功能

CD56是一种细胞粘附分子,在发育和分化过程中参与细胞-细胞以及细胞-基质的相互作用。CD56与细胞外基质成分(如成纤维细胞生长因子受体和N-钙粘蛋白)相互作用。它还触发涉及FYN粘着斑激酶(FAK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的信号级联反应。

在神经系统发育过程中,CD56调节神经发生、神经突生长、轴突引导、突触形成和细胞迁移。在造血系统中,CD56参与T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞的扩增。3,4在人类中,CD56是NK细胞的常见表型标记物。 

 

 

]结构


CD56亚型是高度糖基化的蛋白质,以其分子量命名。5较大的亚型是跨膜蛋白,而NCAM-120没有细胞内残基。

  • NCAM-180具有较大的胞质结构域。
  • NCAM-140具有较短的胞质尾区。
  • NCAM-120通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)与细胞膜相连。

NCAM-120是免疫细胞中的主要亚型。6

 

 

CD56与疾病

CD56可用作一种生物标记物检测神经系统恶性肿瘤(如髓母细胞瘤和星形细胞瘤)、恶性NK/T细胞淋巴瘤和神经内分泌癌。7 由于其在多种癌症中过度表达,已开发出抗CD56抗体-药物偶联物(例如lorvotuzumab mertansine7和promiximab-duocarmycin)。8 CD56也可作为其他疾病的替代标记物,例如COVID-19和与阿尔茨海默病相关的痴呆。9

 

 

]抗原分布

 CD56在脑中以及在CD16+自然杀伤(NK)细胞、T细胞亚群和树突细胞上表达,不在骨髓细胞、红细胞或B细胞上表达。激活后,NK淋巴细胞上的CD56表达增强。7非人灵长类动物淋巴细胞上的CD56表达与人外周血淋巴细胞上观察到的结果相似,其CD16+细胞亚群共表达CD56。10克隆MY31适用于检测非人灵长类动物中的CD56。 

 CD56和CD16表达可用于表征NK细胞群。CD16+CD56dim NK细胞占外周血NK细胞群的90%,可迁移到炎症部位。其特征为具有细胞溶解活性,且颗粒酶、穿孔素和溶细胞颗粒表达水平高,但细胞因子水平低。相反,CD16-CD56bright NK细胞产生IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-10和IL-13等细胞因子。因此,此类细胞迁移至次级淋巴器官且细胞毒性较弱。10

 

 

CD56检测应用示例

我们内部开发的克隆R19-760与流式细胞术应用中的选择性固定和破膜缓冲液兼容。BD科学家将R19-760整合到16色抗体实验方案中,以表征细胞毒性T细胞和NK细胞的亚群。通过检测颗粒酶K、颗粒酶B和穿孔素来分析这类细胞群的细胞溶解潜能。11

 

 

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参考文献

  1. Schlossman SF. Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens: Proceedings of the Fifth International Workshop and Conference, Held in Boston, USA, 3-7 November, 1993. Oxford: Oxford University Press; 1995.
  2. Bennett IM, Zatsepina O, Zamai L, Azzoni L, Mikheeva T, Perussia B. Definition of a natural killer NKR-P1A+/CD56-/CD16- functionally immature human NK cell subset that differentiates in vitro in the presence of interleukin 12. J Exp Med. 1996;184(5):1845-1856. doi:10.1084/jem.184.5.1845
  3. Crotta S, Stilla A, Wack A, et al. Inhibition of natural killer cells through engagement of CD81 by the major hepatitis C virus envelope protein. J Exp Med. 2001;195(1):35-42. doi:10.1084/jem.20011124
  4. Umezawa Y, Kuge S, Kikyo N, et al. Identity of brain-associated small cell lung cancer antigen and the CD56 (NKH-1/Leu-19) leukocyte differentiation antigen and the neural cell adhesion molecule. Jpn J Clin Oncol. 1991. doi:10.1093/oxfordjournals.jjco.a039467
  5. Van Acker HH, Van Acker ZP, Versteven M, et al. CD56 homodimerization and participation in anti-tumor immune effector cell functioning: A role for interleukin-15. Cancers. 2019;11(7):1029. doi:10.3390/cancers11071029
  6. Yu L, Lu Y, Yao Y, et al. Promiximab-duocarmycin, a new CD56 antibody-drug conjugates, is highly efficacious in small cell lung cancer xenograft models. Oncotarget. 2017;9(4):5197-5207. doi:10.18632/oncotarget.23708
  7. Solana C, Tarazona R, Solana R. Immunosenescence of natural killer cells, inflammation, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimer’s Dis. 2018;2018:1-9. doi:10.1155/2018/3128758
  8. Hong HS, Rajakumar PA, Billingsley JM, Reeves RK, Johnson RP. No monkey business: Why studying NK cells in non-human primates pays off. Front Immunol. 2013;4. doi:10.3389/fimmu.2013.00032
  9. Baracho GV, Kara N, Rigaud S, Lo E, Widmann SJ, Tyznik AJ. Functional phenotyping of circulating human cytotoxic T cells and NK cells using a 16-color flow cytometry panel. STAR Protocols. 2022;3(1):101069. doi:10.1016/j.xpro.2021.101069

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CD56克隆和应用
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CD56克隆和应用

 

在与固定剂接触时,CD56特异性抗体结合表位可能会受到破坏,从而限制了某些抗体试剂在细胞内染色工作流程中的应用。BD提供三种克隆(MY31、B159和NCAM16.2),在未固定细胞的CD56检测中具有最佳性能。BD已开发出克隆R19-760,用于在未固定和固定细胞中检测CD56,帮助进行细胞内染色。此外,在与CD56的结合过程中,克隆R19-760与MY31和NCAM16.2竞争,并与B159存在部分竞争,这表明这类克隆可能是受体占有率测定的候选克隆。 

 

 

BD货号中抗人CD56抗体的克隆对比汇总。 

 

抗人CD56克隆
  MY31

B159

NCAM16.2

R19-760

表位/免疫原

来自KG1α细胞系的220/135 kDa高度糖基化抗原

人NK细胞

人脑的胞外免疫球蛋白样结构域 重组CD56的胞外结构域

交叉反应

狒狒、恒河猴、猕猴

同型

小鼠IgG1,κ

小鼠IgG1,κ 小鼠IgG1,κ小鼠IgG1,κ  

研讨会

V NK19

V NK79

V NK60

NA

应用

流式细胞术

流式细胞术 流式细胞术

流式细胞术
(胞内)*
细胞固定后染色
非竞争性克隆 NCAM16.2, R19-760 NCAM16.2 MY31, B159, R19-760 NCAM16.2, MY31

*与BD Cytofix™ 固定缓冲液、BD Phosflow™ 裂解/固定缓冲液、BD Phosflow™ 破膜缓冲液I和BD Phosflow™ 破膜缓冲液III兼容

使用不同的抗CD56克隆分析CD56表达。

使用BD Horizon™ 小鼠抗人CD3以及以下具有最佳溶度的PE小鼠抗人CD56克隆对人全血进行染色:MY31、B159、NCAM16.2或R19-760(分别与上图对应[从左至右])。显示CD3与CD56表达的双变量伪色密度图是由具有完整白细胞群侧向和前向光散射特征的圈门事件得出的。在BD FACSymphony™ A5 SE流式细胞仪上采集样本,并通过传统补偿分析数据。

CD56-Fresh-WB

与固定及破膜缓冲液的兼容性

细胞内工作流程中的CD56染色

细胞内流式细胞术需使用固定和破膜缓冲液来处理细胞,这可能会对抗体结合产生影响。开发了克隆R19-760并定期对其进行检测,以便在细胞内工作流程中检测CD56。下图显示R19-760与BD Cytofix™固定缓冲液、BD Phosflow™裂解/固定缓冲液以及BD Phosflow™破膜缓冲液III兼容。 

CD56-Staining-In-Intracellular-Workflows

细胞固定和透化后,用抗 CD56、克隆 R19-760 对人外周血淋巴细胞进行染色。

BD Phosflow™ 裂解/固定缓冲液(10 分钟,37 °C)处理全血以裂解红细胞并固定白细胞,然后用 BD Phosflow™ Perm 缓冲液 III(30 分钟,在冰上)使白细胞透化。然后用 BD Horizo​​n™ PE-CF594 小鼠抗人 NCAM-1 (CD56) 克隆 R19-760(货号 564963)和 BD Horizo​​n™ BV421 小鼠抗人 CD3(货号 562426/ 562427) 抗体。显示相关 CD56 与 CD3 表达的双变量伪彩色密度图源自具有完整外周血淋巴细胞的前向和侧向光散射特征的门控事件。使用 BD LSRFortessa™ 细胞分析仪系统FlowJo™ 软件进行流式细胞术和数据分析。

固定细胞表面染色

克隆R19-760的开发旨在对未固定和固定细胞进行相似染色,以便增加细胞内工作流程设计的灵活性。下图展示了两种可能的工作流程:未固定细胞上的CD56染色,以及固定细胞上的CD56染色。与克隆MY31、B159和NCAM16.2相比,R19-760染色不易受细胞固定的影响。

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使用不同的抗CD56抗体对人外周血单核细胞(PBMC)进行染色。

在离心后对PBMC进行染色(不固定或使用1X BD Cytofix™固定缓冲液在4°C下固定30 min)。未固定和固定细胞均使用BD Horizon™ BV480小鼠抗人CD3和以下一种PE小鼠抗人CD56克隆进行染色:MY31、B159、NCAM16.2或R19-760。双变量伪色密度图是由具有完整细胞侧向和前向光散射特征的圈门事件得出的。在BD FACSymphony™ A5 SE流式细胞仪上采集样本,并通过传统补偿分析数据。

竞争性结合检测

 

 针对相同抗原的非竞争性抗体可用于竞争性结合检测,以测定受体占有率。在与CD56的结合过程中,克隆NCAM16.2不与R19-760、B159和MY31竞争。R19-760不与MY31或NCAM16.2竞争,但与B159存在部分竞争。

 

 

  MY31

B159

NCAM16.2

R19-760

MY31

 

ND

_ _

B159

ND

 

_

+

NCAM16.2

_

_   _

R19-760

_

+

_  

抗人CD56克隆用于竞争性结合检测时的表位识别重叠

- = 无竞争,+ = 部分竞争,ND = 无数据

CD56抗体的竞争性结合检测。 

Anti-Human-CD56-antibodies-competitive-binding-assay

与胶原酶处理的兼容性

 胶原酶处理通常用于从组织中生成单细胞悬液。下图显示了胶原酶对CD56检测(人PBMC)的影响。1 经过60 min的胶原酶处理后,没有一个克隆在CD3+细胞上检测到CD56。但是,克隆R19-760和NCAM-16.2在CD3细胞上清晰辨认出了CD56。与其他克隆相比,在经过30 min的胶原酶处理后,R19-760和NCAM-16.2能够更好分离CD3+CD56+细胞和CD3-CD56+细胞。 

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参考文献

  1. Frutoso M, Mair F, Prlic M. OMIP-070: NKp46-Based 27-Color Phenotyping to Define Natural Killer Cells Isolated From Human Tumor Tissues. Cytometry A. 2020;97(10):1052-1056. doi:10.1002/cyto.a.24230

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仅供研究使用,不用于诊断或治疗