免疫组化检验

Overview

免疫组化检验（IHC）是一种强有力的工具，其利用特异性抗体的能力来检测组织样品中的重要抗原。免疫组化检验广泛应用于肿瘤组织的病理评价、预测肿瘤预后、预测治疗反应、确认感染的存在以及用于众多研究应用领域。¹除了检测抗原的存在或缺失外，免疫组化检验还有助于测定抗原的分布和位置。

免疫组化检验的原理

首先确定重要组织，进行石蜡包埋或冷冻保存，然后切片。对保存的切片进行处理（石蜡包埋切片采用脱蜡法，冷冻切片采用加热法），以便进行抗原修复，然后，用抗原特异性抗体进行免疫染色。正如蛋白质印迹法或酶联免疫吸附测定法，免疫组化可以是直接的或间接的（仅使用一种抗体或者将一抗和二抗结合起来）。通常，采用酶【如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）】来完成检测。用显微镜观察样品。

免疫细胞化学、免疫组化和免疫荧光 - 有哪些区别？

免疫组化的原理与免疫细胞化学（ICC）相似，但免疫组化使用组织样品，而ICC使用细胞。

免疫细胞化学（ICC）和免疫组化（IHC）均采用免疫标记抗原进行分析，并采用免疫荧光法。有时，免疫细胞化学法和免疫荧光法可以互换使用。

免疫细胞化学法侧重于细胞水平的分析，而免疫组化允许对整个组织进行检查。这两种方法都使用免疫荧光进行检测。也可以采用酶促检测（例如，使用3,3’-二氨基联苯胺（DAB））。

参考

Duraiyan J, Govindarajan R, Kaliyappan K, Palanisamy M. Applications of immunohistochemistry. J Pharm Bioallied Sci. 2012;4(Suppl 2):S307-S309. doi: 10.4103/0975-7406.100281

免疫组化检验样品的制备

免疫组化样品的制备

一旦获得了组织样品，最重要的是对其进行保存，使组织结构尽可能完整，使抗原尽可能接近采集时的状态。制备方法的选择还会影响样品的长期储存和抗原检测的容易程度。

固定剂的选择取决于待检测抗原以及分析类型（例如，形态或表达）。

组织固定：

免疫组化检验中，通常使用4%多聚甲醛（PFA）来保存组织样品。虽然该固定方法可以很好地保存组织结构，但是其会引起构象变化，从而可能影响抗原表位的正确检测。由于甲醛诱导的表位掩蔽，抗原修复剂通常用于增加获得抗原的可能性。

作为甲醛的替代品，可将锌等温和固定剂用于石蜡包埋切片。除甲醛和锌外，乙醇或丙酮也可用于固定免疫组化样品。

组织包埋

固定组织样品后，对组织样品进行石蜡包埋，以便能够进行组织切片。通常，采用石蜡来制备用于切片的试样块。另一种组织制备方法是快速冷冻样品。虽然冷冻是一种快速方法，并且可以保存抗原表位，但是冷冻过程中形成的冰晶会改变组织结构。

组织切片

组织切片可以生成切片，这些切片可作为免疫组化实验的染色基质。石蜡包埋组织需要切片机进行切片，而冷冻组织则使用低温恒温器进行切片。

BD Pharmingen™ 免疫组化锌固定剂是一种温和固定剂，能保持抗原和组织的完整形态，特别适用于白细胞标志物的检测，并能保持甲醛固定组织的相同结构。将BD Pharmingen™免疫组化锌固定剂与BD Pharmingen™ Retrievagen A（pH 6.0）和Retrievagen B（pH 9.5）溶液结合起来，可进一步增强某些表位的抗体反应性。

免疫组化检验的抗原修复法

采用两种主要抗原提取方法来揭示因包埋而被掩蔽的抗原表位，并提高表位的免疫活性活动：¹

蛋白酶诱导表位修复（PIER）

蛋白酶诱导表位修复（PIER）又称为酶修复，其利用蛋白酶的化学反应来修复组织固定过程中产生的交联。该方法通常用于修复难以恢复的表位。该方法使用具有中性pH值的酶（如胰蛋白酶、蛋白酶K）缓冲溶液。因为该方法是一种具有非特异性酶反应的苛刻修复方法，所以过度培养会破坏组织结构以及重要表位。

热诱导表位修复（HIER）

热诱导表位修复（HIER）依靠加热和加压来修复抗原表位。虽然PIER使用中性缓冲溶液，但是根据靶抗原的不同，可以采用不同的pH值。

BD生物科学公司提供了两种有效的抗原修复试剂BD Pharmingen™ Retrievagen A（pH 6.0）和Retrievagen B（pH 9.5）溶液，它们特别适合与BD Pharmingen™ IHC锌固定剂固定的组织结合使用。

参考

Ireka Y, Agustina H, Aziz A, Hernowo BS, Suryanti S. Comparison of fixation methods for preservation cytology specimens of cell block preparation using 10% neutral buffer formalin and 96% alcohol fixation in E-cadherin and Ki-67 immunohistochemical examination. Open Access Maced J Med Sci. 2019;7(19):3139-3144. doi: 10.3889/oamjms.2019.452.

免疫组化检验方法

直接和间接免疫组化检验方法

描述了两种主要的免疫染色方法：

直接法

直接免疫组化检验法采用单结合抗体来检测重要抗原表位。该方法用于检测不需要任何扩增的极丰富抗原。

间接法

间接免疫组化检验法采用两个抗体染色步骤——首先，使专用于所需抗原的一抗与抗原结合，然后，采用专用于一抗种类的二抗生成可通过显微镜检测的信号。间接免疫组化检验法得到了广泛应用，因为该方法可以更好地检测中低表达抗原的信号。

检测方法的选择取决于多种因素，如抗原丰度、分布以及组织样品的制备方法。¹

免疫组化检测方法

比色检测

比色或显色免疫组化法是利用酶及其底物之间的反应，在反应位置产生显色沉淀。两种主要的酶检测系统是辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。BD生物科学公司提供了一系列可以与这些酶一起使用的底物，如BD Pharmingen™ DAB 底物显色试剂盒和BD Pharmingen™ AEC底物显色试剂盒。

荧光检测

荧光免疫组化法是使用与荧光团耦合的抗体。当该荧光团被特定波长的光激发时，会发出可以用荧光显微镜观察到的荧光信号。BD生物科学公司提供了一系列用于免疫组化的荧光耦合二级抗体。

提高免疫组化染色质量

为了更好地显示免疫组化染色，您应该仔细计划您的实验，从良好的组织收集着手，并选择最适合检测目标抗原的方法来准备您的样本。

信号放大

信号可以用多克隆抗体放大，该抗体可以识别一个单一抗原的多个表位。也可采用与多种复合物结合的二抗，以及聚合物基法、亲和素-生物素复合物法（ABC）和标记链霉亲和素生物素法（LSAB）等其他方法。

非特异性结合的减少

BD生物科学公司提供了封闭试剂，以帮助减少非特异性结合和提高信噪比。也可以使用在染色过程中检查背景噪音的试剂，如用于免疫组化的BD Pharmingen™抗体稀释液。

使用BD生物科学公司的抗体所生成的免疫组化样本数据

除了抗体和试剂，BD生物科学公司还提供经过验证的免疫组化规程。

参考

Magaki S, Hojat SA, Wei B, So A, Yong WH. An introduction to the performance of immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 2019;1897:289-298. doi: 10.1007/978-1-4939-8935-5_25

仅供研究使用，不用于诊疗程序。