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BSB Protocol FAQ

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BD 荧光补偿FAQ

BD® 补偿微球涂有免疫球蛋白,它可以结合大多数荧光结合抗体,作为细胞的替代。微球易于使用,能产生每个荧光的峰值。然而,所有微球局限性在于,由于它们不是真实的染色细胞,溢漏值可能与染色细胞不同。

BD®补偿微球具有种属和κ链特异性。确保您的BD®补偿微球与您检测的试剂的种属和轻链都兼容。我们提供的BD®补偿微球具有多种种类和规格(货号552843、552844、552845;BD®补偿微球 Plus,货号:560497、560499)

不能,补偿控制试剂的发射光谱(溢漏值%)应与实验中使用的试剂相同。即使类似的荧光染料,如FITC,Alexa Fluor™ 488和GFP,发射光谱也不同,这可能导致每种染料的溢漏值不同。这也适用于活/死细胞染料,如PI、7-AAD和BD Horizon™ 等染料

不同批次的串联染料的溢漏值显著不同。因此,我们建议对串联染料进行批次特定补偿。在您的实验中,每种串联染料都应有补偿调节。

我们建议用与样品制备相同的方法处理补偿调节。这包括在同一天制备、使用相同试剂(例如,相同的缓冲液,用BD Horizon Brilliant™ Stain Buffer(BSB)进行补偿调节等等),以及相同的培养时间和储存时间。用相同试剂在不同时间生成的数据可能存在差异,从而影响样品的补偿结果。

图1:CD4 BD Horizon Brilliant™ UV 805(BUV805)和CD8 BD Horizon Brilliant Violet™ 786(BV786)抗体,用BSB预混2小时(“预混合”)。用这些抗体对冷冻和解冻PBMC进行染色,然后清洗、固定和获取。左图使用BSB预培养两小时的试剂计算补偿,右图使用新鲜制备的混合抗体试剂计算补偿。与相同试剂处理组对比,使用新鲜试剂组的补偿调节不足。

是。在同一实验中使用两种或两种以上BD-Horizon™染料时,请使用BD-Horizon™ Stain Buffer(BSB),以防止染料相互作用的造成的影响。当在多色实验中使用BSB时,最好在单色补偿管中也使用BSB。该缓冲液与BD®补偿微球兼容,但尚未用其他供应商提供的补偿微球进行检测。

 

当使用两种或两种以上BD Horizon Brilliant™试剂时,应使用BD Horizon™ Stain Buffer或BD Horizon™ Stain Buffer Plus,以进行多色免疫荧光染色和流式细胞术分析。用BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421)小鼠抗人CD4和BD Horizon™ BV711小鼠抗人CD19抗体,对人全血进行染色。用BD FACS™裂解液裂解红细胞(货号349202)。等高线图显示CD4 vs CD19相关表达,与未用Stain Buffer染色的细胞(左图)相比,用BD Horizon™ Stain Buffer染色(货号563794/566349;右图)的主要淋巴细胞群体显示为预期结果(虚线)。上述结果用BD LSRFortessa™ Cell Analyzer System进行流式细胞技术分析。

在补偿获取期间,荧光参数的电压必须保持不变,但FSC和SSC电压可以改变。在结合细胞和微球进行补偿时,这尤其有用,这些细胞和微球可能不在FCS/SSC图的相同位置。

通常,当使用细胞创建补偿时,使用阴性管来定义阴性细胞群。当结合细胞和微球时,对于使用细胞单染管作为补偿对照的荧光,创建阴性门P3。这也适用于使用微球作为对照的染料(除7-AAD和其它区分细胞死活的染料外)。

在正补偿控制的亮度范围内时,计算出的补偿值才正确。如果补偿控制偏离范围,我们建议滴定加入对照组的抗体量,而不是调整PMTV。

这些染料与BD®补偿微球的搭配效果不是最佳,用BD®补偿微球得到的染料之间溢漏值可能无法为细胞提供正确的补偿。细胞单染管对照可提供更准确的补偿结果。