基于细胞的检测分析测量细胞进程，如增殖、活力、凋亡和调节网络，以及细胞的功能方面，如磷酸化和细胞因子分泌。使用基于细胞的检测分析，可以检测整个目标通路，并可以测量多个步骤，产生细胞内实际发生的功能读数。BD生物科学公司提供几种细胞内细胞因子信号转导试验；细胞周期、细胞活力和增殖测量；以及评估磷酸化事件。
细胞周期、增殖、活力和凋亡分析
在真核细胞中，细胞的生长、复制和分裂，是按照高度控制系列事件（被称为细胞周期）而发生的。在适应性免疫中，特异性T和B淋巴细胞在外源抗原刺激下，进行克隆性扩增（分裂、增殖和分化）。流式细胞术、免疫荧光或免疫组化可用于快速确定细胞周期状态，并通过代理，确定细胞对刺激的反应。
细胞周期和细胞DNA含量分析
BD生物科学公司为细胞周期的研究，提供各种各样的试剂。试剂包括碘化丙啶（PI）、7-氨基放线菌素D（7-AAD）等核酸染料。此外，BD Cycletest™Plus试剂盒还包括PI和其他试剂，可以降解蛋白质和RNA（核糖核酸），从而实现更精确的DNA检测。随后使用流式细胞术分析样本，以评估倍性、识别异常DNA干细胞系并估计干细胞系的DNA指数(DI)和细胞周期时相分布。在细胞周期的各个阶段，DNA水平发生改变，便于使用DNA染料（如7-AAD）以产生特征性的细胞DNA含量变化图（见下图）。
当细胞经历细胞周期的各个阶段时，诸如组蛋白H3 Ser28这样的蛋白，在表达上发生了修饰或改变。为了促进DNA复制，组蛋白被修饰，从而打开染色质，允许复制机制进入。为了进一步支持细胞周期的研究，BD生物科学公司将这些蛋白的抗体用于成像或流式细胞术应用。
掺入溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）和总DNA水平（7-AAD）染色细胞群的细胞周期分析。
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采用抗CD3 /CD28刺激人类PBMCs 48小时，再用PMA+离子霉素刺激4小时，最后1小时添加BrdU。然后收获细胞，采用BrdU染色方案染色。选通R3含有G0阶段细胞， 选通G4含有S-阶段细胞，选通R5含有G2/M-阶段细胞，选通R6含有开始失去核酸含量的凋亡或坏死细胞。
细胞增殖检测
细胞增殖是细胞数量的增加，是细胞生长和分裂的结果。细胞增殖和凋亡之间平衡，对于细胞的发育和正常的组织稳态都很重要。多种刺激，如细胞因子处理或受体与纯化抗体交联，可影响细胞增殖。
采用BrdU测定细胞增殖
BD生物科学公司携带一系列抗体和试剂盒，设计用于通过测量BrdU检测增殖细胞，BrdU是用于测量DNA从头合成的DNA前体胸苷的类似物。
在细胞周期的S期（DNA合成），BrdU掺入到新合成的DNA中，可以很容易地通过抗BrdU特异性抗体检测到。设计用于检测BrdU的BD抗体和试剂盒可用于细胞内流式细胞术和免疫组织化学，包括BD Horizon™Violet 450(V450)、BD Horizon Brilliant Violet™510(BV510)、BD Pharmingen™PerCP-Cy5.5和其他形式。
除了DNA增加之外，某些蛋白质的水平也会随着细胞增殖而上升。例如，Ki67是一种在分裂细胞细胞核中表达的抗原。然而，在细胞周期的G0阶段，没有检测到它。Ki67可以与其他增殖标志物（如BrdU和VPD450）结合使用，以增加可信度。这些标记物还可以与细胞表面和其他类型的标记物结合，以获得关于细胞亚群及其信号传导途径方面的额外信息。
细胞凋亡和细胞死亡分析检测
凋亡过程，具有一定的形态学特征。这包括质膜的改变（如膜对称性的丧失和膜附着的丧失）、细胞质和细胞核的凝结、蛋白质的分裂、以及DNA的核小体间分裂。在这一过程的最后阶段，死亡的细胞分裂成凋亡小体，并且接着被吞噬细胞清除，而对周围细胞没有造成明显的炎症性损伤。BD生物科学公司提供了全方位的细胞凋亡检测工具和技术，用于测量凋亡过程中不同阶段的指标。
膜联蛋白V—细胞凋亡信号传导的关键蛋白
质膜改变是在活细胞中检测到的细胞凋亡过程的特征之一。细胞凋亡可以通过磷脂酰丝氨酸(PS)的存在来检测，PS通常位于质膜的细胞质表面。在细胞凋亡过程中，PS转位到质膜的外叶，当钙存在时，可通过与荧光染料标记的膜联蛋白V结合，通过流式细胞术和细胞成像进行检测。
BD生物科学公司提供几种常见形式的膜联蛋白V，包括FITC、PE、用于紫色激光器的BD Horizon™BV421、用于紫外激光器的BD Horizon Brilliant™UV 395(BUV395)等。随着这些新形式的加入，可以开发更复杂的检测方法来观察异质性细胞亚群内的细胞凋亡。
由于如果质膜受损，细胞内膜联蛋白V也会暴露，因此通常使用膜不渗透染料（如7-AAD）区分凋亡和死亡细胞，以排除死亡细胞。膜联蛋白V染色的细胞群仅代表凋亡细胞群。
裂解的半胱天冬酶和PARP的测定
观察到的细胞凋亡最一致的特征之一是一系列胞质蛋白酶的激活，称为半胱天冬酶，在细胞凋亡的最早阶段，在天冬氨酸残基裂解时被激活。然后活性半胱天冬酶可以切割许多蛋白质，包括多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、其他半胱天冬酶和其他蛋白底物。这导致细胞结构和功能的丧失，最终导致细胞死亡。特别是半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-3与细胞凋亡有关：线粒体通路中的半胱天冬酶-9、Fas/CD95通路中的半胱天冬酶-8和下游的半胱天冬酶-3，由多种通路激活。
BD Biosciences现有多种试剂可测量半胱天冬酶，特别是半胱天冬酶-3。包括仅针对半胱天冬酶活性形式的抗体。这些抗体有多种形式，可用于流式细胞术、成像、酶联免疫吸附测定和免疫印迹法。
半胱天冬酶-3裂解/抑制反应
活性半胱天冬酶-3与荧光Ac-DEVD-AMC底物结合，并在天冬氨酸(D)和AMC之间裂解，释放荧光AMC。采用紫外荧光分光光度法定量测定AMC荧光。Ac-DEVD-CHO醛抑制剂与半胱天冬酶-3活性位点强烈结合，并阻断底物结合。因此，Ac-DEVD-AMC未裂解，且不发射荧光。
BD生物科学公司提供了几种分析细胞周期、增殖、细胞死亡和凋亡的方案。
磷蛋白质分析
酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化对于控制参与各种细胞事件的蛋白活性至关重要。多种激酶和磷酸酶在许多不同的细胞信号通路中调节细胞内蛋白磷酸化，例如T和B细胞信号通路，调节细胞凋亡、生长和细胞周期控制的通路，以及参与细胞因子、趋化因子和应激反应的通路。历史上一直使用放射性激酶测定和磷酸氨基酸标记等技术进行磷蛋白质检测。但磷酸化特异性抗体的出现促进了更直接的技术的使用，如蛋白质印迹法、免疫沉淀和免疫荧光显微镜。然而这些技术有几个缺点，它们需要相对大量的样品，耗时长，不能产生真正的定量结果，不利于多参数分析。
磷蛋白分析将磷酸化特异性抗体与流式细胞术的力量相结合，以增强磷蛋白质分析。流式细胞术只需要较小的样本量，是对单细胞和不同细胞亚群进行快速、定量、多参数分析的理想选择。BD Phosflow™试剂能够使用流式细胞术对单细胞或亚群进行细胞内磷蛋白质分析。
高内涵细胞成像使研究人员能够可视化其微环境中的蛋白磷酸化，
并同时研究蛋白质-蛋白质相互作用和
易位事件。
检测瞬时磷酸化事件：BD Phosflow™试剂技术
创新的BD Phosflow™试剂技术，是第一个完整的流式细胞术解决方案，用于揭示细胞系和原代细胞的基础和诱导蛋白磷酸化事件的细胞内数据。BD Phosflow™试剂方法对于研究T细胞尤其有用，其中信号蛋白的磷酸化导致特定T细胞表型的表达。
BD生物科学公司的BD Phosflow™方案用于不同样本类型。
BD Cytofix/Cytoperm™试剂方法
BD Cytofix/Cytoperm™试剂方法和相关试剂，满足了基础研究中广泛存在的实验需求。由于产品的细胞因子和种类选择范围大，所以Cytofix/Cytoperm™试剂为细胞内细胞因子染色，提供了最大的灵活性。BD生物科学公司，提供了若干种通过细胞内流式细胞仪测量细胞内细胞因子的解决方案。
BD FastImmune™系统
BD FastImmune™系统旨在满足人类样本应用研究的需求。随着对完整系统的关注，这种方法非常适合监测疾病期间免疫状态，或对候选疫苗的免疫反应的研究。BD FastImmune™CD4细胞内细胞因子检测试剂盒Anti-Hu-TNF-α/CD69/CD4/CD3旨在用于检测全血中抗原激活的CD4+ T淋巴细胞中的细胞内细胞因子和激活标记物CD69。其应用，包括研究T细胞对抗原（如疱疹病毒抗原、HIV抗原和肿瘤抗原）的应答。BD生物科学公司，提供了若干种通过细胞内流式细胞仪测量细胞内细胞因子的解决方案。
BD FastImmune™细胞因子系统工作流程概述。
细胞内细胞因子分析
对于细胞内蛋白检测，需要细胞必须被固定和破膜，从而使得荧光抗体进入并检测感兴趣的目标蛋白。由于不同的抗原对固定和破膜有不同的敏感性和要求，所以需要额外的优化方案。为了检测细胞因子（即分泌蛋白），蛋白质转运抑制剂需要捕获细胞内的蛋白质。BD生物科学公司提供了两种广泛使用的分析系统，用于细胞内细胞因子的检测：BD Cytofix/Cytoperm™试剂和BD FastImmune™细胞因子系统。这两个系统都为研究人员提供了使用试剂和方案的便利性和信心，这些试剂和方案经过优化后一起使用，并结合了BD流式细胞术产品已知的高标准质量和再现性。BD Phosflow™试剂帮助您使用多色流式细胞仪测量参与T细胞信号传导的磷酸化蛋白水平，并将数据与亚群鉴定相结合。
分泌细胞因子的分析
为了检测样品中分泌细胞因子，BD提供多种检测方法。BD®流式微珠测定（CBA）技术，可以同时定量分析多种可溶性细胞因子，而BD OptEIA™ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂，设计用于定量分析单个细胞因子。BD®ELISPOT（酶联免疫斑点测定法）试剂，可以测定细胞因子产生细胞的频率，而BD®体内捕获测定方法，可以通过直接捕获体内细胞因子进行定量分析。
BD生物科学公司为酶联免疫吸附测定和其他免疫分析提供了几种方案。
趋化因子和趋化因子受体的生物测定
趋化检测和钙动员测定用于表征趋化因子及其受体的生物活性。
趋化检测
趋化检测是基于靶细胞对趋化因子梯度的定向迁移。用于大多数测定的仪器是20世纪60年代开发的博伊登室。1现代趋化检测已经适应了几种修饰，例如用细胞外基质蛋白（例如胶原、纤连蛋白）或内皮细胞单层预包被膜，
以模拟体内环境。BD生物科学公司使用的趋化检测采用48孔趋化室(Neuro Probe,Cabin John,MD)。2
另一种改良的趋化检测，通过测定细胞裂解后的乳酸脱氢酶(LDH)计数迁移细胞，也用于测定趋化因子的生物活性。简言之，将具有3或5μm孔径膜的迁移小室混悬于含有对照和趋化因子的24孔培养板的孔中。将靶细胞加入迁移小室中。孵育后，通过LDH检测测定迁移细胞的数量
测定。3释放的LDH量与四唑盐(INT)酶转化为红色甲瓒成正比，使用ELISA酶标仪可以很容易地在490nm波长的光下测定。
钙动员测定
胞质游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的瞬时增加可为参与细胞信号传导的许多配体跨膜受体系统提供细胞活化的指征。因此，可以使用测定由配体引起的瞬时[Ca2+]i通量水平或被直接激活配体或其受体的抗体阻止的检测，测定这些生物活性分子的水平和比活度。
钙离子在细胞内信号传导中发挥着独特的作用，被认为是细胞信号通路的重要第二信使。趋化因子、过敏毒素和其他炎症介质与其细胞受体结合后可能触发钙动员反应。在这些情况下，受体与配体相互作用激活位于膜内部的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白。因此，异源三聚体G蛋白激活磷脂酶C，裂解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，释放甘油二酯和三磷酸肌醇。肌醇三磷酸引起细胞内钙库释放Ca2+，而甘油二酯和胞浆Ca2+水平升高与细胞内蛋白激酶C的激活有关。磷酸化事件的增加又与这些活化细胞产生氧化剂和分泌功能有关。
可用的荧光指示剂染料种类繁多，如Indo-1和Fura-2，与Ca2+络合后改变其荧光性质。例如，当使用激发光波长设定为约358nm的荧光分光光度计时，Indo-1的荧光发射最大值从无Ca2+介质中的约485nm移动至染料被Ca2+饱和时的约405nm。Ca2+结合染料和无Ca2+染料的荧光比值可用于测定[Ca2+]i。这些染料的细胞渗透性乙酰氧基甲基(AM)酯可被动装载到细胞中，在细胞内酯酶将其裂解为细胞不可渗透产物。为进行钙动员测定，用Indo-1加载靶细胞，置于荧光分光光度计内的温控(37°C)搅拌比色皿中，并在358nm光波长下激发。在405和485nm处测定基线发射后，将刺激物（趋化因子、过敏毒素或其他炎症介质）快速注射到细胞悬液中。在接下来的120-300秒内连续监测并记录发射的荧光灯信号。
如果配体具有刺激性（即，使其受体在细胞内转导信号，导致Ca2+从细胞内储存动员到细胞质中），则胞质游离Ca2+水平（通过发射比(E405/E485)反映）迅速增加。随后[Ca2+]i降低至基线水平。胞质游离Ca2+的瞬时增加幅度取决于用于激活靶细胞的刺激配体浓度，从而可测定ED50。
其他方法
除上述方法外，还采用了几种方法测定某些趋化因子的生物活性。包括CC和CXC趋化因子的CD11b/CD18上调试验；CXC趋化因子的中性粒细胞弹性蛋白酶或β-葡萄糖醛酸酶释放试验和中性粒细胞氧化爆发试验；MIP-1α和MIP-1β的造血集落形成试验；以及CC趋化因子的组胺释放试验。
参考
- Boyden S. The chemotactic effect of mixture of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 1962;115(3):453-466. doi: 10.1084/jem.115.3.453
- Leonard EJ, Sylvester I, Yoshimura T. Measurement of human neutrophil attractant protein-1 (NAP-1; IL-8). In Coligan JE, Kruisbeek M, Margulies DH, Shevach EM, Strober W, eds. Current Protocols in Immunology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience; 1992.
- Nachlas MM, Margulies SI, Goldberg JD, Seligman AM. The determination of lactic dehydrogenase with a tetrazolium salt. Anal Biochem. 1960;1:317-326. doi: 10.1016/0003-2697(60)90029-4
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