基于荧光成像的技术对于查询细胞和组织的结构和功能方面非常有用。当与免疫化学结合时，荧光成像技术的分析能力大大增加，增强了这种技术在广泛的研究和临床应用中的实用性，使其成为宝贵的工具。免疫荧光显微镜通过使活细胞成像能够可视化整个细胞器，彻底改变了细胞生物学领域。免疫组织化学和免疫细胞化学是结合抗原抗体结合能力进行细胞分析的常用荧光成像技术。
什么是免疫荧光，它有什么应用？
免疫荧光（IF）是一种强大的免疫染色技术，利用显微镜观察与靶蛋白和其他目标分子结合的荧光素标记抗体。免疫荧光用于鉴定细胞中的细胞和组织特异性抗原；可视化蛋白质的存在与否、细胞定位和活化状态；并分析免疫反应。
免疫荧光的原理和类型
免疫荧光利用荧光分子或荧光团在一定波长（分子的吸收光谱）下吸收光子的特性，经过短暂的间隔（发射光谱）后以较高的波长发射光子，并伴随能量损失。发射的荧光可通过显微镜观察到。荧光团可以通过可见光或紫外光激发。
具有高光稳定性和荧光量子产率的荧光染料可在市场上购买，其激发最大值跨越从400到>700nm的波长范围。它们不会损伤活细胞，可安全用于生物制剂。
在进行免疫荧光检测时，首先对细胞或组织进行固定和透化处理。进行免疫染色时，荧光团与目标抗原的抗体结合，然后使用成像显微镜观察荧光信号。根据使用的抗体和所需的信号扩增，免疫荧光可分为直接和间接两种类型。
直接免疫荧光
单抗体（一抗）用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合，并使用成像显微镜观察。
直接免疫荧光的优点：
- 由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性，从而降低了物种交叉反应性问题
- 与间接免疫荧光相比，时间缩短（操作步骤减少）
直接免疫荧光的缺点：
- 不允许通过二抗进行信号放大
- 检测灵敏度降低
- 荧光素结合一抗的选择有限
- 与使用荧光二抗的检测相比，更昂贵
间接免疫荧光
使用两种抗体（一抗和二抗）进行免疫染色并检测目标蛋白。首先，用特异性一抗标记目标蛋白。然后，荧光素结合的二抗（与一抗具有不同的物种反应性）识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合，荧光信号被放大，提供了更高的检测灵敏度。
直接免疫荧光法
间接免疫荧光的优点：
- 通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大
- 与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度
- 荧光标记二抗的选择广泛
- 与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低
间接免疫荧光的缺点：
- 由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加
- 与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）
间接免疫荧光或二次检测
什么是免疫荧光显微镜，它有什么应用？
直接和间接免疫荧光均利用成像显微镜观察荧光信号。根据实验需要和要求，使用荧光或共聚焦显微镜进行成像。
落射荧光或宽视野荧光显微镜
允许可视化细胞形态、细胞蛋白的存在和定位以及细胞表型的标记和分析。
共聚焦显微镜
当需要高分辨率样本的3D图像时使用。用于分析蛋白质的亚细胞定位、共定位和蛋白质-蛋白质相互作用。
典型荧光显微镜通道
免疫细胞化学、免疫组化和免疫荧光 - 有哪些区别？
免疫细胞化学（ICC）和免疫组化（IHC）均采用免疫标记抗原进行分析，并采用免疫荧光法。有时，免疫细胞化学法和免疫荧光法可以互换使用。
免疫细胞化学法侧重于细胞水平的分析，而免疫组化允许对整个组织进行检查。这两种方法都使用免疫荧光进行检测。也可以使用酶促检测（例如使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB））。
稳定易用的5色成像
免疫荧光检测相对于酶检测的优势
- 定量荧光信号的能力（与使用基于酶的方法进行的定性测定相反）
- 复用能力（可以结合不同发射光谱的荧光染料来检测多种蛋白质）
- 荧光染料的光稳定性
BV染料的光稳定性
持续暴露在激发光下。细胞：MCF7细胞。固定：BD Cytofix™固定缓冲液（目录号：554655）。抗体：采用BD Horizon Brilliant Violet™480（BV480）山羊抗小鼠（目录号：564877）、BD Horizon Brilliant Violet™421（BV421）山羊抗小鼠（目录号：563846）、或Alexa Fluor®488山羊抗小鼠（赛默飞世尔科技）纯化的小鼠抗人CD324（目录号：562869）。其它试剂：ProLong®Gold抗淬灭封片剂（赛默飞世尔科技）。仪器：ImageXpress® Micro系统（美谷分子仪器公司），20倍物镜。
BD生物科学公司免疫荧光成像产品组合
BD生物科学公司提供高质量的荧光成像工具，其中包括单克隆抗体、荧光染料、第二步试剂和缓冲液的全面研究组合。我们提供了免疫荧光以及组织切片制备和染色的方案。
免疫荧光成像方案和资源
我们还提供方案帮助支持您的样本制备和免疫荧光分析
BD生物科学公司用于成像应用的荧光染料建立在我们荧光成像的经验基础上，并使用从Sirigen公司获得的聚合物染料技术。我们的荧光团的特殊亮度使其具有更好的灵敏度。独特的光谱更易于复用。
了解更多关于BD Horizon Brilliant Violet™成像试剂的信息
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使用荧光显微镜和DAPI染色时推荐的滤光片配置
通道 染料 激发（nm） DC (nm) 发射（nm） 优化的滤光片组 蓝色 DAPI 377/50 409 430/24或440/40 Chroma滤光片或Semrock滤光片 水绿色 BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)445/20或438/24 458 483/32 Chroma滤光片或Semrock滤光片 绿色 FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30或485/20 506或495 537/26或525/50 Chroma滤光片或Semrock滤光片 橙色 Alexa Fluor® 555、 Alexa Fluor® 568 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 红色 Alexa Fluor® 594 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 远红外 Alexa Fluor® 647 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 推荐的滤光片配置采用BD Horizon Brilliant Violet™480(BV480)，以改进免疫荧光分析。
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使用辐射荧光和DAPI以外的核复染剂时推荐的滤光片配置
一种较亮染料的配置：BD Horizon Brilliant Violet™421(BV421)，用于改进免疫荧光分析。
通道 染料 激发（nm） DC (nm) 发射（nm） 优化的滤光片组 蓝色 BD Horizon Brilliant
Violet™ 421 (BV421)392/23或377/50 409 430/24或447/60 Chroma滤光片或Semrock滤光片 水绿色 BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)445/20或438/24 458 483/32 绿色 FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30或485/20 506或495 537/26或525/50 Chroma滤光片或Semrock滤光片 橙色 Alexa Fluor® 555、 Alexa Fluor® 568 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 红色 Alexa Fluor® 594 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 远红外 Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 推荐的滤光片配置采用BD Horizon Brilliant Violet™421(BV421)，以改进免疫荧光分析。
两种较亮染料的配置：BD Horizon Brilliant Violet™421(BV421)和BV480，用于改进免疫荧光分析
通道 染料 激发（nm） DC (nm) 发射（nm） 优化的滤光片组 蓝色 BD Horizon Brilliant
Violet™ 421 (BV421)392/23或377/50 409 430/24或440/40 Chroma滤光片或Semrock滤光片 水绿色 BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)438/24或445/20 458 483/32 Chroma滤光片或Semrock滤光片 绿色 FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30或485/20 506或495 537/26或525/50 Chroma滤光片或Semrock滤光片 橙色 Alexa Fluor® 555、 Alexa Fluor® 568 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 红色 Alexa Fluor® 594 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 远红外 Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何优化的滤光片组 任何供应商 -
使用激光共聚焦显微镜时推荐的滤光片配置
多达5色配置 激光线 染料 DAPI必需 405 nm DAPI 440或458 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) 488 nm Alexa Fluor® 488或GFP 561 nm Alexa Fluor® 568或RFP 633 nm Alexa Fluor® 647 备用DNA染色剂 405 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) and
BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)440 nm或458 nm 激光线非必需 488 nm Alexa Fluor® 488或GFP 561 nm Alexa Fluor® 568或RFP 633 nm DRAQ5™或Alexa Fluor®647
使用BD生物科学公司抗体和试剂生成的样本数据
用BD Cytofix™固定缓冲液（目录号：554655）固定表达CX3CR1-绿色荧光蛋白（伪绿色）和CCR2-红色荧光蛋白（伪红色）小鼠的脾脏冷冻切片（5µm），用在1X PBS中稀释的5%山羊血清和1%BSA封闭，用BD Horizon Brilliant Violet™421（BV421）大鼠抗小鼠CD4（目录号：562891）（伪紫红色）、Alexa Fluor®647大鼠抗小鼠CD45R/B220（目录号：557683）（伪黄色）和BD Horizon Brilliant Violet™480（BV480）大鼠抗小鼠CD3分子复合物（伪青色）染色。用ProLong®Gold抗淬灭封片剂（赛默飞世尔科技）封片，并在BD Pathway 435细胞分析仪（荧光显微镜）上采集图像，并使用BD Attovision软件合并。20倍物镜。与拉荷亚过敏和免疫学研究所的Catherine Hedrick实验室合作开展。
用BD Cytofix™固定缓冲液（目录号：554655）固定MCF-7细胞（ATCC、HTB-22），用0.1% Triton™ X-100透化，并用含5%山羊血清、1% BSA、0.5% Triton™ X-100的1X PBS封闭。用纯化的小鼠抗E-钙粘蛋白（目录号：610182）孵育细胞，第二步试剂为BD Horizon Brilliant Violet™480（BV480）山羊抗小鼠（目录号：564877）（伪水绿色）。然后用直接结合抗体对细胞染色：Alexa Fluor®488小鼠抗β微管蛋白（目录号：558605）（伪绿色）、Alexa Fluor®555小鼠抗人Ki-67（目录号：558617）（伪紫色）、Alexa Fluor®647小鼠抗GM130（目录号：558712）（伪红色）。DAPI（目录号：564907）用作核复染剂（伪蓝色）。用ProLong®Gold抗淬灭封片剂（赛默飞世尔科技）封片，并在BD Pathway 435细胞分析仪（荧光显微镜）上采集图像，并使用BD Attovision软件（BD生物科学公司）合并。20倍物镜。
用BD Cytofix™固定缓冲液（目录号：554655）固定H9人胚胎干细胞系的培养细胞，用在1X PBS中稀释的0.1% Triton™ X-100进行透化处理，并用在1X PBS中稀释的5%山羊血清、1% BSA和0.5% Triton™ X-100封闭，用BD Horizon Brilliant Violet™421(BV421)小鼠抗SSEA-1（目录号：562705）、BD Horizon Brilliant Violet™480(BV480)小鼠抗CD324（E-钙粘蛋白）（目录号：565646）、Alexa Fluor®488小鼠抗Oct3/4（目录号：561628）和Alexa Fluor®555小鼠抗人Ki-67（目录号：558617）染色。使用DRAQ5™（目录号：564902）作为核复染剂。用ProLong®Gold抗淬灭封片剂（赛默飞世尔科技）封片，并在BD Pathway 435细胞分析仪（荧光显微镜）上采集图像，并使用BD Attovision软件合并。20倍物镜。
细胞：H9人胚胎干细胞（WiCell公司，威斯康星州麦迪逊市）。固定：BD Cytofix™固定缓冲液（目录号：554655）;透化：BD Phosflow™透化缓冲液III（目录号558050），组织块/染色：含5%山羊血清、1% BSA、0.5% Triton™ X-100的1X PBS。抗体：使用BD Horizon Brilliant Violet™480(BV480)山羊抗小鼠（目录号：564877）、BD Horizon Brilliant Violet™421(BV421)小鼠抗人TRA-1-60抗原（目录号：562711）的纯化小鼠抗Oct3/4a（目录号：561555）。其它试剂：DRAQ5™ (BioStatus)，ProLong®Gold抗淬灭封片剂（赛默飞世尔科技）。仪器：使用BD Attovision软件（BD生物科学公司）合并BD Pathway 435细胞分析仪和图像。20倍物镜。
BD生物科学公司免疫荧光试剂的应用
仅供研究使用，不用于诊疗程序。
Alexa Fluor和ProLong是赛默飞世尔科技公司的商标。DRAQ5是BioStatus有限公司的商标。ImageXpress是美谷分子仪器公司的商标。Triton是Dow公司的商标。
