B淋巴细胞是一种适应性免疫细胞亚群，在胎儿肝脏和出生后的骨髓中开始成熟。虽然众所周知，B细胞可以通过产生抗体来支持体液免疫，但是它们还具有其他重要功能，比如吞噬功能和抗原呈递功能。属于B细胞谱系的细胞表达CD19和其它标记物。1B细胞目前仍然是一个研究热点，它们在免疫系统中起着关键的作用。B细胞发育或功能的紊乱，与几种疾病状态相关。了解B细胞功能和功能障碍的基本原理，对于开发新的疫苗和治疗方法具有特别的意义。从细胞内及表面标记物到分泌蛋白和功能测定，BD生物科学公司提供了最新的试剂和方法，来进行健康状态和疾病状态下的B细胞生物学研究。
研究专业人员概述
B细胞是如何发育的?
B细胞在接触抗原之前和之后，会经历许多发育阶段。随着它们的成熟和分化，它们会产生多个功能不同的亚群。细胞表面和细胞内标记物的差异表达，以及它们不同的免疫球蛋白和细胞因子分泌谱，为不同B细胞亚群的各种性质和功能研究提供了依据。例如，syndecan-1（CD138）的表达，将循环浆母细胞和浆细胞（“专职的”分泌抗体的B细胞）与其他发育和功能亚群区分开来。未能成功完成发育过程，将导致成熟B细胞的凋亡。为了支持使用多色流式细胞仪来研究B细胞，BD公司提供了广泛的B细胞表型试剂组合。它们有多种格式可供选用，为检测panel设计提供了最大的灵活性。该示意图，概括了小鼠和人类各个B细胞亚群的主要发育和分化阶段，以及相关的一些关键标记物。
常规的B细胞成熟
B细胞来源于骨髓中的造血干细胞（HSCs），它们在骨髓中经历了发育的第一阶段。仍未成熟的B细胞迁移到次级淋巴组织，在次级淋巴组织大多数未成熟的B细胞继续发育为成熟的滤泡性B细胞。当某个成熟B细胞的B细胞受体（BCR）复合物（其由IgM和IgD的膜结合形式（m）组成）与它的同源外源性抗原结合时，细胞被激活并且分化为分泌抗体的浆细胞。2
具有不同功能的B细胞亚群
B细胞具有多种不同的分化途径，产生了具有不同功能和标记物表达模式的亚群。例如，边缘区（MZ）的 B细胞具有类似天然细胞的功能。与传统的B细胞不同，它们可以绕过BCR，直接通过Toll样受体（TLR）的连接反应而被激活。同时，它们往往表达CD1d和CD21，而不是表达CD23。具有调节功能的B细胞亚群已经被鉴定出来了，并通过其分泌IL-10或TGF-β-1的能力加以区分了。3
B细胞成熟的分析
通过提供小鼠和人类标记物的大量抗体，BD公司可以支持多种表型检测panel，用于所有发育阶段的B细胞研究。为了说明标记物表达在B细胞分析中的应用，我们使用了7个细胞表面标记物来分析小鼠骨髓中的B细胞亚群，这样可以区分该组织中的7个不同的发育阶段。根据BP1和CD24的差异表达，在低阳性CD45R/B220细胞群中可以区分Pre-pro-B细胞、Pro-B细胞和Pre-B细胞。根据IgM和IgD的差异表达，可以分离未成熟、过渡性和早/晚成熟的B细胞。IL-7受体CD127的表达则随着B细胞的成熟而降低。
参考
- Martínez-Riaño A, Bovolenta ER, Mendoza P, et al. Antigen phagocytosis by B cells is required for a potent humoral response. EMBO Rep. 2018;19(9):e46016. doi:10.15252/embr.201846016
- Yam-Puc JC, Zhang L, Zhang Y, Toellner KM. Role of B-cell receptors for B-cell development and antigen-induced differentiation. F1000Res. 2018;7:429. doi:10.12688/f1000research.13567.1
- Matsushita T. Regulatory and effector B cells: Friends or foes? J Dermatol Sci. 2019;93(1):2-7. doi:10.1016/j.jdermsci.2018.11.008
B细胞的类型
浆细胞
众所周知，B细胞能够产生中和外来物质的抗体。抗体分泌细胞（ASCs），其包括浆母细胞和浆细胞，其缺乏CD20B细胞标记物，在人类中表达为CD27、CD38和CD138的组合。浆母细胞在适应性免疫应答的早期发挥作用，产生低亲和力免疫球蛋白，并且寿命短。而浆细胞分化程度更高，并且是由短寿命细胞亚群和长寿命细胞亚群共同组成的。短寿命浆细胞在寿命和抗体分泌率方面与浆母细胞相似，浆母细胞表达所有的免疫球蛋白（Ig）类型，浆细胞往往表达IgM和IgG。长寿命的浆细胞，具有最长的寿命以及最高的抗体分泌率，免疫球蛋白（Ig）同型的寿命和分泌率的关系如下：IgG > IgA >IgM。4
效应B细胞
效应B细胞或B-eff，通过抗原呈递对免疫应答起到支持作用，并且分泌细胞因子（例如IL-2、IL-6、GM-CSF、IL-12、IL-17、IFN-γ（即γ干扰素），TNF-α）来诱导巨噬细胞（例如，IFN-γ）激活、T细胞分化（IL-6分化为Th17）以及浆细胞分化产生抗体。3同时，效应B细胞在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）和多发性硬化症（MS）中支持浆细胞分化以产生自身抗体，从而促成未经调节的免疫应答。在MS（多发性硬化症）中，CD138+ B细胞已经显示出在脑脊髓液（CSF）中积累。5
调节性B细胞
由于B细胞分泌细胞因子来调节免疫细胞的功能，在自身免疫中，巨噬细胞和树突状细胞衍生的BAFF（B细胞激活因子），可以诱导效应B细胞和调节性B细胞（B-reg）之间的平衡。在SLE（系统性红斑狼疮）中，过量的BAFF通过浆细胞促进自身抗体的产生，同时抑制IL-10（产生B-regs）的激活。这些IL-10分泌的调节性B细胞大部分可以通过CD9（88%）和肿瘤坏死因子受体2 （TNFR2）的表达来鉴定。3，6
参考
- Tellier J, Nutt SL. Plasma cells: The programming of an antibody-secreting machine. Eur J Immunol. 2019;49(1):30-37. doi:10.1002/eji.201847517
- Matsushita T. Regulatory and effector B cells: Friends or foes? J Dermatol Sci. 2019;93(1):2-7. doi:10.1016/j.jdermsci.2018.11.008
- Knier B, Hiltensperger M, Sie C, et al. Myeloid-derived suppressor cells control B cell accumulation in the central nervous system during autoimmunity. Nat Immunol. 2018;19(12):1341-1351. doi:10.1038/s41590-018-0237-5
- Fillatreau S. Regulatory functions of B cells and regulatory plasma cells. Biomed J. 2019;42(4):233-242. doi:10.1016/j.bj.2019.05.008
B细胞功能的测定
产生抗体
对B细胞分泌的免疫球蛋白和细胞因子的类型和数量的检测，可以深入了解其免疫应答的质量和数量 – 而这些特征在疾病状态下也经常发生改变。
可以进行多路测量的方法，正在越来越多地被用于检测免疫球蛋白（Igs）和细胞因子。除了多路分析的好处之外，与传统的技术相比，它们还有若干独特的优势。
BD®流式微珠阵列法：多路定量分析
BD®流式微珠阵列法（CBA) 是一种基于微珠的免疫分析方法，可以同时定量分析来自同一样品的多种分析物。BD®CBA人类免疫球蛋白Flex Set系统，提供了现成的试剂。因为在一种特定的免疫应答中抗体的数量和类型可能有很大的差异，所以测量这些参数可以提供对免疫或疫苗接种后反应的深入了解，或者作为评估免疫球蛋白缺乏症的一项指标。例如，BD®CBA分析法，已经被用于分析炎症过程中B细胞分泌的Igs和细胞因子。7
细胞因子的产生
B细胞根据其激活状态，分泌一系列不同的细胞因子。
| Cell Type | Cytokines Secreted |
|---|---|
| B effector 1 (Be-1) | IFN-γ, IL-12, TNF |
| B effector 2 (Be-2) | IL-2, IL-4, IL-6. TNF |
| Regulatory B | IL-10, TGF-β1 |
细胞因子的BD®CBA分析
细胞因子所用的BD®CBA Flex试剂盒，为方便且高效的多因子分析而设计，包括特异性的多种人类和小鼠细胞因子。BD®CBA标准与NIBSC/WHO国际标准之间的数据比较结果，可用于帮助对不同实验室或方法来确定细胞因子浓度值。同时，测量分泌细胞因子，可以提供样本中不同功能B细胞亚群活性方面的信息，比如分泌抗炎细胞因子（如IL-10）的B效应因子-1或-2、或者调节性B细胞（B-regs）。BD®CBA Flex试剂盒已经被用于在慢性病毒感染的个体中定量分析B细胞相关的细胞因子和趋化因子，如HIV和恶性疟原虫感染。8，9
细胞内信号传导
B细胞的发育、激活和分化，伴随着一系列细胞内分子的变化，包括转录因子、磷酸化信号传导蛋白和细胞因子。BD公司提供了独特的解决方案，能够分析这些细胞内分子，从而支持研究人员解析调控B细胞生物学研究的途径。多色流式细胞术是一种强大的技术，可以用于分析细胞内分子。同时分析特定细胞亚群的标记物，可以揭示不同群体B细胞的分化和激活状态方面。虽然细胞表面染色技术是相对标准的，但是，细胞内标记物的最佳染色往往取决于目标蛋白的生物学特性。
为了便于流式细胞仪检测这些特定的细胞内分子，BD公司已经开发了单克隆抗体、专用缓冲液系统和试剂盒。与常用的方法（如蛋白质印迹法）相比， 流式细胞术 有几个优点，比如可以从血液等异质性样本中同时测量多个参数。保存了珍贵的样本，并且提供了细胞水平的详细结果。
小鼠淋巴结细胞，采用抗CD45R/B220、CD4、IgD和CD95进行染色，采用BD Pharmingen™转录因子缓冲液试剂盒进行固定和破膜，然后采用抗Bcl-6 Alexa Fluor™488进行染色。采用一个BD®LSR II系统进行流式细胞仪检测。在生发中心B细胞中，观察到Bcl-6表达。
转录因子的检测
BD Pharmingen™转录因子缓冲液，能够对细胞充分破膜，从而实现核内表位暴露，同时仍然保持足够温和，同时也可以检测大多数的细胞表面蛋白。其既可以单独使用，也可以与细胞表面标记物和细胞因子联合使用，以提高对不同转录因子的检测。BD生物科学公司提供了几种与B细胞相关的流式验证转录因子抗体，包括独特的特异性。有些标记物（如Oct-2和Pax-5），是通过滤泡或生发中心（GC）阶段表达的。Bcl-6以增殖的GC B细胞为特征，而其他的标记物（如Blimp-1和XPB-1s）则是典型的浆细胞。
磷蛋白的检测
BD Phosflow™抗体，是经流式细胞仪检测验证的单克隆磷酸化表位特异性抗体。虽然大多数BD Phosflow™抗体的推荐破膜缓冲液是BD Phosflow™Perm缓冲液III，但是也可用其它的破膜缓冲液可以满足特定的实验需求。
许多BD Phosflow™抗体特异性，可以用于分析参与B细胞发育和激活的信号传导途径，包括phospho-Akt、phospho-Btk、phospho-Syk、phospho-BLNK、phospho-CD20/BL-CAM、 phospho-IKKγ、 phospho-NFκB以及phospho-mTOR。
细胞因子的检测
通过使用蛋白转运抑制剂来来阻止细胞因子分泌，研究人员可以检测细胞（细胞因子在该细胞中产生）中的细胞因子。这就使得我们可以很容易地确定一个活化细胞群产生的细胞因子，是少数细胞产生大量细胞因子的结果，还是大量细胞群每个细胞产生少量细胞因子的结果。
用于胞内细胞因子染色的BD试剂盒、缓冲液系统和方案，包括BD Cytofix/ Cytoperm™固定/破膜溶液，其适用于大部分细胞因子和细胞表面标记物的染色。有多种直接偶联物可供选择，包括经常用于区分B-regs的细胞因子，以及B效应-1 （Be-1）和B效应-2 （Be-2）细胞分泌的细胞因子。
参考
- Lu Y, Liu F, Li C, Chen Y, Weng D, Chen J. IL-10-producing B cells suppress effector T cells activation and promote regulatory T cells in crystalline silica-induced inflammatory response in vitro. Mediators Inflamm. 2017;2017:8415094. doi:10.1155/2017/8415094
- Kardava L, Moir S, Wang W, et al. Attenuation of HIV-associated human B cell exhaustion by siRNA downregulation of inhibitory receptors. J Clin Invest. 2011;121(7):2614-2624. doi:10.1172/JCI45685
- Ambegaonkar AA, Kwak K, Sohn H, Manzella-Lapeira J, Brzostowski J, Pierce SK. Expression of inhibitory receptors by B cells in chronic human infectious diseases restricts responses to membrane-associated antigens. Sci Adv. 2020;6(30):eaba6493. doi:10.1126/sciadv.aba6493
B细胞免疫表型的工具
多色研究非常适合于B细胞的研究，因为它们本质上需要使用比其它细胞（例如，T细胞）更多的标记物来确定样本中存在的基本亚群。
骨干标记物
大量的B细胞研究中使用细胞表面标记物来确定主要的B细胞亚群，并且这些构成了“骨干”或核心标记物，供检测panel进行更详细的分析。B细胞检测panel的关键标记物是谱系标记物CD19，几乎所有B细胞谱系的细胞都表达CD19。在小鼠中，传统方法中使用CD45R/B220。大部分检测panel还包括表面表达的IgD和IgM，因为BCR同型提供了关于B细胞分化阶段方面的信息。
多色流式细胞仪
当采用两束激光测量一个五个标记物的panel时，通常使用的荧光染料会溢出到其他荧光通道，因此需要进行补偿。使用具有四/五束激光的仪器，可以一定程度减少补偿的需要。
多色流式实验的仪器设置
使用四色抗体检测panel进行多色实验的仪器设置，是非常耗时的。五激光仪器通常配备有一个355 nm的紫外激光，用于侧群分析，而钙测量使用indo-1或活性检测。
为了让用户可以充分利用该设备进行检测，BD公司已经开发了一种由紫外线激发的新聚合物染料，即BD Horizon Brilliant™紫外光395 （BUV395）。
将偶联到BUV395的抗体加到panel中， panel中各个荧光染料被不同的激光所激发，抗体之间产生的溢出最小或者没有溢出。这是用五色panel的例子来说明初始B细胞和记忆B细胞的区别。使用这个检测panel，只需要进行最小的设置，并且实际上不需要进行任何补偿。
在本例中，9个细胞表面标记物用于分析小鼠脾脏中的B细胞亚群。它们可以区分该组织中存在的不同发育阶段的B细胞。通过IgM、IgD、CD21和CD23的表达，鉴定了卵泡B I和II以及边缘细胞亚群（边缘区和边缘区祖细胞）。IgM和CD23的不同表达水平，可以帮助区分过渡性亚群的不同阶段（T1、T2和T3）。Pax-5在不同亚群中的表达测定表明，Pax-5在滤泡区和边缘区B细胞中的表达存在差异。
结合不同检测方法使结果最优化
现在，缓冲液系统和方法的进步，使同时测量细胞表面和细胞内标记物变得更为容易。例如，在分化B细胞的异质样本中，可以使用细胞表面和细胞内标记物的组合方法来同时监测几种细胞类型，从而有效地从各个样本中获得更多的相关数据。在许多不同的偶联物中，包括新的BD Horizon™染料，抗体对B细胞表面标记物和特定转录因子的可用性，增加了设计多色实验时的灵活性。
基本检测panel
根据所分析的样本类型，可以选择不同的标记物来确定感兴趣的特定B细胞亚群。本例中，采用CD19、CD20、IgD、CD27、CD38和CD24来分析人类的外周血。通过这个六色检测panel，可以鉴定过渡性B细胞（CD24high、CD38high），区分初始细胞和记忆细胞（初始细胞为CD27-IgD+，记忆细胞为CD27+IgD -），并且鉴定浆母细胞（CD38+）。10
深度检测panel
由于某些亚群的表型与其他亚群的非常相似，所以通常需要一个更为深入的分析检测panel。例如，一个检测panel可以区分存骨髓B细胞中的众多发育阶段的B细胞。通过添加marker，还可以提供更为详细的分析，例如，确定记忆细胞或不同类型的浆细胞，以及其他一些分子（如趋化因子受体，CD62L）为提供了细胞归巢和再定位研究提供线索。通过添加marker（CD69、CD25、 CD80、 CD86），可以得知哪些亚群被激活，并且为个体的免疫应答提供重要线索。
搭建 panel的工具
抗原密度。 当添加marker到某个检测panel上时，研究人员可以利用抗原密度来优化抗体荧光的选择。一般而言，对于低抗原密度的标记物，我们推荐选择较亮的荧光染料，而对于高表达的标记物，我们推荐选择相对暗的荧光染料。BD公司正在研究关于外周血细胞上众多标记物的抗原密度的信息。 明亮的荧光与弱表达相结合。 某些B细胞非常罕见，或者是由弱表达的抗原确定的B细胞，在染色实验中达到足够的分辨率是获得良好数据的关键。特别是对于这样稀有或弱表达细胞群，使用非常明亮的荧光染料有助于提高分辨率。许多B细胞标记抗体可以偶联到非常明亮的BD Horizon Brilliant Violet™（BV）染料上，比如BV421、BV510和BV605。
用于确定其它亚群的延伸panel
在设计该10色分析实验所用的检测panel时，抗原密度方面的信息有助于优化荧光染料的分布。低密度抗原CD138选择明亮的荧光染料，以分辨具有不同IgD和CD38表达水平的细胞群，并且使用极亮的BV染料，使得对CD27和IgM的检测达到最佳。使用该检测panel进行分析，增加了关于Ig亚类表达的信息，从而可以同时鉴定IgG+和IgG-类别记忆细胞（IgM–IgD–CD38–CD27+/dim），并且可以清楚地区分浆细胞（IgM–IgD–CD20–CD38++）。
参考
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- Finak G, Langweiler M, Jaimes M, et al. Standardizing flow cytometry immunophenotyping analysis from the human immunophenotyping consortium. Sci Rep. 2016;6:20686. doi:10.1038/srep20686
仅供研究使用，不用于诊疗程序。
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