光谱流式细胞术如何改变荧光染料在高维研究中的开发前景

我们对细胞有了前所未有的深入了解。随着对细胞生物学和细胞分子特征的了解日益加深，我们对开发一种工具以询问并探究细胞之间复杂关系的需要也更甚。流式细胞术是一种强大的免疫表型分析技术，可分析不同的细胞群。近年来，荧光染料开发技术的进步使得可用于流式细胞术的荧光染料数量呈指数级增长。与此同时，仪器功能也随之增加，如增加了激光器和检测器数量，以及可测量参数的数量。但随着仪器复杂性和可用荧光染料的增加，也带来了更多与流式细胞术多色实验方案设计相关的挑战。这种复杂性意味着研究人员需仔细研究每个荧光团的滤光片所定义的光谱范围，以此设计多色实验方案，同时需选择正确的荧光团以避免荧光溢出和扩散。因此，荧光染料的开发很大程度上受限于滤光片所收集的发射光谱范围。

光谱流式细胞术通过探索荧光染料的完整发射模式，消除了这一障碍。光谱流式细胞术的出现为开发大量新染料以扩展多色实验方案提供了更多可能性。在此，我们考虑了传统流式细胞术和光谱流式细胞术的差异，并展示光谱流式细胞术如何改变荧光染料的开发前景。

传统流式细胞术与光谱流式细胞术：主要区别是什么？

荧光染料与检测器之间的关系

两种流式细胞术的主要区别在于流式细胞仪中检测器的光谱覆盖范围。在传统流式细胞仪中，荧光染料的发射光谱由单个检测器采集。但检测器仅覆盖一部分荧光染料发射光谱，其覆盖范围由单个滤光片界定。具有适当带宽的滤光片可检测荧光染料的发射峰，并避开激光线、重叠区域以及没有可用荧光蛋白的区域。因此，在传统流式细胞术中，荧光染料和检测器之间存在1对1的关系。为覆盖整个可见光谱，需在传统流式细胞仪中添加额外的检测器。

在光谱流式细胞仪中，荧光染料的整个发射光谱由多个检测器或检测阵列采集。对于每个激光器，发射光通过棱镜、滤光片或光栅均匀分割，并被引导至整个光谱的各个检测器中。在这种情况下，荧光染料与检测器存在1对多的关系。因此，一般而言，光谱流式细胞仪中的检测器数量多于传统流式细胞仪，尽管一些复杂的传统流式细胞仪（如BD FACSymphony™ A5细胞分析仪和BD FACSymphony™ A3细胞分析仪）与某些光谱流式细胞仪的荧光检测器数量相同。通过光谱流式细胞仪能够采集更多数据点，从而实现更精细颗粒的信号分离，以提高荧光染料之间的分辨率。

补偿和光谱解析

在传统流式细胞仪中，单个荧光染料的部分发射光谱由单个检测器采集。但是单个荧光染料可被多个激光激发；因此在一个检测器中测量的总荧光数量可能来自多个荧光染料。在传统流式细胞仪中，补偿过程用于从重叠光谱中减去背景信号。

光谱流式细胞仪测量光谱中荧光染料的完整发射模式。光谱解析算法能够区分单个荧光染料的光谱图。与传统流式细胞仪相比，这种解析高度重叠荧光染料（如FITC和BD Horizon Brilliant™ Blue 515 [BB515]）的单个光谱特征的能力增加了可在光谱流式细胞仪中同时使用的荧光染料数量。这也使得与传统流式细胞仪相比，光谱流式细胞仪能够设计更大、更复杂的多色实验方案。

开发具有不同光谱特征的新荧光染料

光谱流式细胞术能够检查整个光谱，这使得开发具有不同光谱特征的新染料成为可能，从而用于高参数分析以获得更高分辨率和更精细颗粒度。新染料技术的开发使BD生物科学不断推陈出新。

新推出的BD Horizon RealYellow™ 586（RY586）荧光染料是BD Horizon RealYellow™ 和RealBlue™ 试剂系列中的首款染料，其利用下一代BD染料技术和AI引导的荧光染料选择来优化光谱定位，从而在与其他荧光染料联用时减少溢出，并提供最佳分辨率。这使其能够在光谱流式细胞仪上与具有高交叉激光激发的染料[如藻红蛋白（PE）]一同使用。

PE荧光染料由蓝激光和黄/绿激光激发，其发射光谱图在紫外、紫色、蓝色和黄绿色检测器上显示明显的发射峰。然而，RY586荧光染料由蓝激光和黄/绿激光激发的交叉激光激发最小，并且在黄绿色波长处显示明显的发射峰，而进入蓝色、紫色和紫外检测器的发射较少。
RY586表现出的蓝激光、紫激光和紫外激光交叉激发明显较少，从而导致溢出减少。该图比较了PE和RY586的标准化发射光谱图，显示进入蓝色、紫色和紫外检测器中的RY586发射较少。