优化COVID-19流式实验的7大技巧
从确定正确的样本类型到免疫细胞活化、染色和定量
感染COVID-19会触发大量涉及多种免疫细胞的免疫应答。流式细胞术是研究COVID-19免疫应答的强有力技术，能在单细胞水平上同时测量多种蛋白质。流式细胞术可用于评估感染病毒后出现的免疫表型变化和功能变化（细胞因子产生、增殖、细胞毒性）。
以下内容节选自我们的科学家整理的COVID-19电子书，旨在帮助您加速COVID-19研究进程。在此我们分享了一些技巧和资源，以帮您避开陷阱并优化流式细胞术实验。
如果您想了解更多关于我们预先设计的用于鉴定各种免疫细胞亚型的多色实验方案的信息，例如初始和记忆T细胞亚群、衰老和衰竭T细胞亚群、调节性T细胞、B细胞、单核细胞等，您可以下载我们的 COVID-19电子书
1. 选择您的样本类型并选用正确的裂解液
用于给定实验的样本类型可能因目标细胞群和/或生物学应用而异。以下通用指南能帮您针对应用选择正确的样本类型。
| 样本类型 | 目标细胞群 | 方案 | 应用示例 |
|---|---|---|---|
| 全血 | 单核细胞和多形核细胞 | 红细胞（RBC）裂解 | 血液中存在的主要免疫细胞的广泛和/或高水平免疫表型 |
| 外周血单核细胞（PBMCs） | 单核细胞 | Ficoll梯度分离 | 主要免疫细胞及其罕见亚群的更深层次免疫表型 |
| 富集T细胞 | T细胞亚群 | 磁性分离 | 体外培养和活化后T细胞的免疫表型 |
些RBC裂解液的缓冲液（BD FACS™ 溶血素）含有固定缓冲液，而其他缓冲液（BD Pharm Lyse™ 裂解缓冲液）则不含。使用含有固定缓冲液的RBC裂解液时，需要考虑抗原完整性和与活性染料的兼容性可能受到的影响。当EDTA代替肝素作为抗凝剂时，BD Pharm Lyse™ 裂解缓冲液和BD FACS™ 溶血素的效果最佳。
- 用BD FACS™ 溶血素裂解RBC后，将细胞置于冰上，以保持粒细胞形态
- 如果目标抗原可能受到固定缓冲液的影响，则在抗体染色后使用BD FACS™ 溶血素进行RBC裂解
- 使用BD Vacutainer® CPT™ 单核细胞制备管加快PBMC分离工作流
2. 抗体检测量和滴定
为节省时间和细胞样本，预滴定的检测量试剂 以最佳浓度装瓶，在相关模型上具有最佳信噪比。技术数据表提供了在该最佳浓度下相关主要模型生成的数据。
- 对于按质量销售的抗体（例如，0.2 mg/mL），需要进行抗体滴定以确定给定细胞类型和应用的最佳浓度
- 查阅您检测量抗体对应的技术数据表，了解用于预先确定最佳浓度的样本类型
- 如果您使用的样本类型或实验条件不同，您可能需要自行滴定，以确定特定应用的最佳浓度
3. 抗体染色
最佳抗体染色所需的方案、试剂和工作流取决于目标抗原（即细胞表面或细胞内标记物）的细胞定位，以及缓冲液对抗原和荧光染料完整性的影响。
- 使用荧光染料（如BD Horizon Brilliant™ Blue、BD Horizon Brilliant™ UV，和/或BD Horizon Brilliant™ Violet染料）时，选择BD Horizon™ Brilliant染色缓冲液可获得最佳染色效果
- 对于需要考虑总染色体积的应用，建议使用BD Horizon™ Brilliant染色缓冲液Plus来减少检测体积
- 在37°C下染色细胞10 min可提高趋化因子受体的分辨率。为剩余的细胞表面标记物添加抗体混合物，并继续您的染色方案
- 了解不同固定缓冲液和透化缓冲液对细胞表面抗原和荧光染料的潜在不良影响
4. 细胞活化
通常需要进行免疫细胞活化来诱导细胞因子产生，并通过流式细胞术进行检测。用于细胞活化的方案和试剂因细胞因子和目标种属而异。
- 使用诸如佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）等刺激物时，请注意一些细胞表面标记物（即CD3、CD4）的潜在下调/内化
- 进行滴定以确定刺激物浓度和孵育时间，从而确保潜在受影响的表面标记物的分辨率和足够的细胞因子产生
- 使用明亮的荧光染料和/或对下调和/或内化标记物进行细胞内染色
5. 细胞内细胞因子染色
进行细胞内细胞因子分析之前，可能需要蛋白质转运抑制剂来捕获细胞内的细胞因子。莫能菌素（BD GolgiStop™）与布雷菲德菌素A（BD GolgiPlug™）这两种常见蛋白质转运抑制剂之间的选择以及孵育时间取决于细胞因子和目标种属。
- 在添加蛋白质转运抑制剂之前，将细胞与刺激物共同孵育或培养至少一小时
- 请注意长时间暴露于蛋白质转运抑制剂（> 18小时）后的细胞毒性
- 如果需要延长孵育时间，请使用毒性较小的BD GolgiPlug™ 抑制剂
- 在研究多种细胞因子时，可将细胞与BD GolgiStop™ 和BD GolgiPlug™ 抑制剂一起孵育，以获得每种细胞因子的最佳分辨率
6. 使用活性染料排除死细胞
活性染料能够排除可能造成染色伪影或改变蛋白质表达模式的死细胞。这在分析含有大量死细胞（例如活化细胞或组织衍生细胞）的样本时尤为重要。核酸染料和可固定活性染料（FVS）这两类主要活性染料之间的选择取决于实验工作流。
- 在无蛋白缓冲液（例如，1X PBS）中固定前，用FVS进行染色，以避免染料隔离和次优染色。
- 用含蛋白的缓冲液（例如，含FBS或BSA的1X PBS）洗涤FVS染色细胞，以去除未结合染料并减少底色。
- 建议对特定细胞类型和/或应用进行FVS滴定
7. Absolute cell count and antigen quantification
流式细胞术分析通常提供目标细胞群的相对频率和荧光信号强度（中位荧光强度，MFI）的信息。BD Trucount™绝对计数管和BD Quantibrite™PE藻红蛋白荧光定量试剂盒是分别设计用于实现绝对细胞计数和细胞表面抗原定量的配套产品。
- 使用BD Trucount™ 绝对计数管时，选择含蛋白的缓冲液（例如，含FBS或BSA的1X PBS），以避免出现细胞凝集和计数不准确
- 使用BD Trucount™ 绝对计数管时，按照裂解/免洗涤程序对全血进行染色，以避免潜在的细胞损失和计数不准确
- 基于荧光染料-抗体比为1:1的假设，使用BD Quantibrite™PE藻红蛋白荧光定量试剂盒进行抗原定量
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