对SARS-CoV-2的免疫应答采用多组学方法研究：

结合蛋白质和基因表达分析的多组学方法有多种应用，包括分析人类对SARS-CoV-2病毒的免疫应答。在本次采访中，意大利帕多瓦Instituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza（IRP）的Barbara Molon博士和Antonella Viola教授团队讲述了他们如何使用单细胞多组学方法研究对SARS-CoV-2的免疫应答。其团队在COVID-19疫情隔离期间安装了BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统并接受了远程培训。Molon博士和团队成员向我们介绍了他们的工作、他们对多组学技术的期望以及多组学技术在免疫学领域的未来。

COVID-19疫情对您的研究有何影响？

 Barbara Molon：我们在免疫学实验室工作，工作重点是研究生理和病理环境下的免疫系统。从一开始，我们感兴趣的内容就不仅仅局限于基础生物学，对于研究中的转化方法，我们同样很感兴趣。具体说来，我们的目标是研究支撑病理情况的主导机制，并利用所得信息制定新型治疗策略，最终改善患者的临床结局，我们以这种方式研究了多种病理因素。多年来，我一直在研究癌症和炎症，可以说炎症是我们研究的一个主要课题。由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19疫情对我们所有人都造成了巨大影响，我们的研究也不例外。

宿主对病毒的免疫应答会影响患者的临床结局，这一点从一开始就很明显。如您所知，目前有几项研究，其内容集中于免疫系统在控制SARS-CoV-2病毒传播中的作用，这也是研究和了解感染过程中宿主-病原体相互作用的一个机会，同时还颇具挑战性，所以我们加入了这个项目。

您为何要通过多组学方法来研究对SARS-CoV-2的免疫应答？

  Barbara Molon：当然，我们已经转而使用单细胞方法，因为细胞异质性是生理性和病理性疾病的一个标志。而且重要的是，生物学家和临床医生认为这种细胞异质性在治疗方面具有重要意义。单细胞分析的使用提出了一个重要要求，那就是要研究疾病的发病机制，为此我们联系了BD专家并向其咨询如何将经典的单细胞转录组学与多组学方法结合起来。我们觉得这一点非常有趣，因为我们相信使用带有转录谱的寡核苷酸偶联抗体可以极大改善免疫细胞群的分辨率和聚类。此外，通过这种方法还可获得转化后的相关信息。我们相信，借此方法能获得更多疾病相关的信息，还能有效增进对细胞的总体认识。

您如何研究对SARS-CoV-2的免疫应答？

  Barbara Molon：目前我们正与帕多瓦大学医院的传染病科以及米兰的Human Technopole合作开展此项目。我们的想法是成立一个工作组，利用多组学方法研究不同时间点（感染期间和感染后）的SARS-CoV-2病毒感染患者。总的来说，我们希望能了解病人在一段时间内的免疫应答动态变化过程，以便更好地表征对病毒的免疫应答，阐明SARS-CoV-2的发病机制，并确定有助于治疗的新靶标。

您的BD Rhapsody™ 系统安装过程如何？

Fabio Munari：我们是在意大利疫情隔离期间安装的BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统。当时我们正在处理COVID-19样本，所以就待在了实验室。安装完成的几天后，BD公司对我们进行了非常完整精确的远程培训，这也是BD公司首次对欧洲机构进行培训！BD的现场应用专家可随时解答疑问和技术问题。不过培训一经结束，我们立刻就能独立顺畅地管理BD Rhapsody™ 系统工作流程。然后我们开始独立工作，并在数周内建立了100多个文库。难度虽高，但我们依然做到了。配备两个BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统很有帮助，因为我们可以同时运行两个微孔板。工作流程得到了极大改善。当然，开始阶段还是困难重重，毕竟我们的经验主要集中于细胞生物学和流式细胞术，而并非基因组学，但我们很快就提高了技能，这一点主要归功于BD的不断支持。举个例子，我们开始这个项目时已经有了清晰的工作计划，但对于要订购的BD panel套装类型和数量以及文库制备所需的所有试剂和仪器，我们依然一无所知。项目时间紧迫，多亏了BD的支持，我们才能在拿到样本后立即开始项目。对我来说，这是一次很好的经历，大家团结协作，在短时间内受益匪浅。

 Roberta Angioni：我们对BD的技术支持非常满意。开始我们只知道要对COVID-19患者样本进行分析哪一类分析。在BD的支持下，我们能够设计实验，使用单细胞多组学方法并收集良好的数据。

Ricardo Sanchez Rodriguez：正如我的同事所说，疫情隔离期间的培训完全不同以往，但BD专家非常专业，在他们的帮助下我们得以在短时间内建立文库。 

您认为以后会更多地将多组学方法与流式细胞术结合使用吗？

 Barbara Molon：我认为，从技术角度来看，细胞分选仪与BD Rhapsody™ 系统两者结合使用会很有效。例如，富集非常罕见的细胞群，并在直接取自患者体内的条件下对其进行研究，而无需任何操作，这将是研究患者标本的理想方式。

  我认为要改进这种方法并降低其成本，这一点非常重要，尤其是对于个性化医学研究来说。有必要改进技术流程并降低成本。这是我从转化的角度持有的想法。

 另一方面，我们也是基础免疫学家，此类技术能帮助我们理解尚未发现的机制。在我看来，这是免疫学的最佳方法之一。

 Fabio Munari：我认为，目前这种技术的主要瓶颈在于测序成本。虽然是种不错的方法，但很多实验室仍然无法负担其成本。

Roberta Angioni：单细胞多组学方法应该结合流式细胞术使用。在我看来，长期以来科学家们一直把研究重点放在特定的细胞类型上，往往低估了它们周围的东西。通过这种分析，我们可以考虑到在不同细胞亚群和不同水平同时进行的修饰，包括转录和蛋白质组差异。

投资回报率高吗？

 Fabio Munari：当然高了。我们还是得对文库进行测序、完成所有分析，但我们相信物有所值。

 Barbara Molon：目前只能说希望如此，也许未来能有所收获。

Ricardo Sanchez Rodriguez：当然。我们所有的质量控制都反映了，为全转录组、免疫panel和VDJ建立不同文库具有高再现性。

多组学与流式细胞术的互补性如何？ 

 Barbara Molon：这两种方法是互补的，但目前我们还没有多组学方法的数据。通过多组学方法可使用多达400种抗体的panel，而我们仅使用了大约52种。我们可以提高数量并获得转录组学相关的大量信息。

 Roberta Angioni： 在我看来，将多组学方法与流式细胞术结合使用有一定优势。事实上，通过流式细胞术，我们可以在很短的时间内获得数百万的事件，从而很好地了解样本的总体情况。这一点对于识别目标细胞亚群的初步阶段可以算得上成功又划算了。后续可以使用多组学方法进行更深入的研究。相反，BD Rhapsody™ 系统可用于对样本进行非靶标分析，无需将视野局限于单一细胞区室。这样一来，流式细胞术则可用于辅助验证所得结果。因此它们可用于多个流程，达成不同目标。同时，它们又是完全互补的，我认为这一策略可能有助于取得重大发现。

您如何看待免疫学的未来？

  Antonella Viola：人类免疫系统识别和消除病原体的研究始终至关重要，未来几年里也是如此。另一方面，我们越来越多地发现，免疫系统的一个基本作用是维持稳态。免疫系统不断与微生物发生相互作用，不是为了被攻击，而是为了达成有益于机体的特定功能，这种相互作用的机制尚未完全明确。微生物和免疫系统进行对话，这两个世界彼此如何交流和影响，这种对话或其中断对我们的健康会造成何种后果，这些极具吸引力的话题都值得深入探究。同时，除了基本事件和一般事件外，还亟需了解免疫应答个体差异性的内在机制。其重要性不仅仅是针对流行病，在免疫相关疾病（如自身免疫性疾病）患者治疗或癌症免疫治疗中也同样重要。识别个体反应和分子特征对于有效制定专为患者设计的治疗方法至关重要。 在这一方面，我认为研究阶段的多组学方法会有很大用处。

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