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由紫激光激发的近红外荧光染料,具有最低交叉激发
BD Horizon RealViolet™ 828(RV828)试剂利用创新的、激光特异性的荧光染料,主要由 405 nm 紫光激光激发,可提供:
- 极低的交叉激发
- 中等亮度,适用于检测中等到高表达的细胞表面和细胞内标记物
- 在紫激光通道下的近红外(NIR)检测位置
RV828 可为中高表达标记物提供更强检测,在光谱流式细胞仪上实现最佳性能
| 格式 | 激发峰 | 发射峰 | 光谱 | 传统 | 相对亮度 | Spillover* (1低,4高) | 替代 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| RV828 | 412 nm | 828 nm | ✓ | - | 1 | Qdot™ 800, NovaFluor™ V800 |
*数值可能因仪器配置与设置而变化。溢出等级基于五激光光谱仪器上的交叉激发,不包含对相邻探测器的溢出。
性能
BD Horizon RealViolet™ 828 试剂具有极低的交叉激发
RV828 具有最小交叉激发
CD4(SK3)RV828、NovaFluor™ V800(NFV800)及 CD4(S3.5)Qdot™ 800 的标准化发射谱。数据采集于 BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪。
RV828 的荧光扩散低于 Qdot™ 800
PBMC 使用以下试剂进行单色染色:CD4 RV828、Qdot™ 800、BUV805、RB824、SBY800 或 APC/Fire™ 810。图中显示 RV828 与 Qdot™ 800 的交叉激发扩散。数据采集于 Cytek™ Aurora 光谱分析仪,使用 FlowJo™ 软件进行光谱解混。
应用
全血使用 CD28 RV828 进行染色,并采用 BD Pharm Lyse™ 溶血缓冲液进行溶血。样本在 BD FACSymphony™ A5 SE 细胞分析仪上采集,并使用 FlowJo™ 软件结合淋巴细胞自发荧光进行光谱解混。
BALB/c 小鼠胸腺细胞首先用 CD4 APC 进行染色,然后使用 BD Pharmingen™ 转录因子缓冲液套装进行固定和透化。随后,细胞使用 RV828 同型对照或 RV828 小鼠抗小鼠 RORγt 抗体进行染色。重叠的直方图显示了 CD4⁺ 胸腺细胞中同型对照(虚线)或 RORγt(实线)的染色水平。样本在 BD FACSymphony™ A5 SE 细胞分析仪上采集,并通过 FlowJo™ 软件进行光谱解混。
PBMC 在使用 2% PFA 固定并使用 BD Phosflow™ Perm III Buffer 透化之前或之后,分别采用 BD Horizon™ RV828 或 NovaFluor™ V800 人 CD4(SK3)进行染色。样本在 Cytek™ Aurora 上采集,并使用 FlowJo™ 软件进行分析。
BD Horizon™ RV828 试剂在货架型试剂与 BD OptiBuild™ 现配试剂之间表现出稳定的性能,并具有批次间一致性。人全血分别使用三批不同的染料批次的 RV828 人 CD3(UCHT1,左)或
CD4(SK3,右)进行染色,随后使用 BD Pharm Lyse™ 溶血缓冲液进行溶血。所有特异性均在 Cytek™ Aurora 光谱分析仪上运行。CD3 和 CD4 在不同的实验中分别测试。
多色流式细胞术
RV828 在 BD FACSDiscover™ A8 上的 24 色 T 细胞活化 panel 中具有良好分辨率
T 细胞亚群的 gating 策略
从健康供体中分离 PBMC,并将其分为两种条件:未刺激组和使用 CytoStim™(Miltenyi Biotec)刺激的组。经过 24 小时后,收集两组样本并使用 CD45 进行标记。向刺激样本中加入 CAR T 细胞。然后使用包含 BD Horizon RealViolet™ 828 和 BD Horizon RealBlue™ 824(RB824)以及 BD® CD19 CAR 检测试剂的 24 色 T 细胞活化 Panel 中剩余的 23 种标记物对样本进行染色,并在 BD FACSDiscover™ A8 细胞分析仪上进行分析。
A)未刺激 PBMC 的 T 细胞表型分析的 gating 策略。
B)伪彩图显示了在与 CAR T 细胞混合的刺激 PBMC 样本中检测 CD19 CAR⁺ T 细胞的情况。等高线图显示了未刺激 PBMC、刺激 PBMC 以及 CD19 CAR⁺ T 细胞中记忆、活化和抑制性标记物的表达情况。
24 色人 T 细胞活化 panel 的荧光染料与标记物分配
| Specificity | Clone | Fluorochrome | |
|---|---|---|---|
| UV 349 nm | CD8 | RPA-T8 | |
CD45 | HI30 | ||
CD25 | 2A3 | ||
| Violet 405 nm | CCR7 | 2-L1-A | |
CD45RA | HI100 | ||
Viability | N/A | ||
CD20 | 2H7 | ||
CD3 | UCHT1 | ||
| Blue 488 nm | CD28 | CD28.2 | |
CD95 | DX2 | ||
CCR6 | 11A9 | ||
CXCR3 | 1C6/CXCR3 | ||
CD127 | HIL-7R-M21 | ||
KLRG1 | Z7-205.rMAb | ||
CD45RO | UCHL1 | ||
| Yellow-Green 561 nm | TIM-3 | 7D3 | |
CD69 | FN50 | ||
TCRγδ | 11F2 | ||
CD56 | B159 | ||
CD16 | 3G8 | ||
CCR4 | 1G1 | ||
| Red 637 nm | CD19 | N/A | |
PD-1 | EH12.1 | ||
TIGIT | TgMab-2 | ||
CD4 | RPA-T4 |
表格注:该 Panel 于 BD FACSDiscover™ A8 上采集。
缓冲体系兼容性
BD Horizon™ RV828 试剂兼容多种固定和透化体系
| Buffers | Results |
| BD FACS™ Lysing Solution and BD Pharm Lyse™ Lysing Buffer | Compatible |
| CellBlox™ Blocking Buffer | Compatible |
| BD Cytofix™ Fixation Buffer | Stable at least 24 hours |
| 1% PFA | Stable at least 24 hours |
| BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation and Permeabilization Solution | Compatible with antibody staining before and after fixation |
| BD FACS™ Permeabilizing Solution 2 | Compatible with antibody staining before and after fixation |
| BD Phosflow™ Perm Buffer III | Compatible with antibody staining before and after fixation |
| EDTA and Heparin | Compatible |
| BD Horizon™ Brilliant Stain Buffer (BSB) | Compatible |
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Poster
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Performance Guide and Chart
Other BD Horizon RealViolet™ and BD Horizon Fluorochromes
BD 流式细胞仪为 Class 1 激光产品。仅供科研使用,不用于诊断或治疗程序。