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BD® CompBead Particles은 대부분 형광 접합 항체에 결합하여 surrogate stained cell 역할을 할 수 있도록 면역글로불린으로 코팅되어 있습니다. 손쉽게 사용 가능하고 각 형광색의 peak를 resolving하여 훌륭한 결과를 도출합니다. 그러나 bead control의 경우 실제 stained cell이 아니기 때문에 spillover 값이 유사한 stained cell과 다를 수 있다는 한계점이 있습니다.
BD® CompBead Particles 는 종 및 kappa chain 특이적입니다. BD® CompBead Particles가 시험 중인 시약의 종 및 light chain과 호환되는지 확인하십시오. 여러 종과 크기에 호환되는 다양한 BD® CompBead Particles를 제공하고 있습니다 (Cat. No. 552843, 552844, 552845; BD® CompBead Plus Particles, Cat. No. 560497, 560499).
아니오. Compensation control 시약의 방출 스펙트럼(% spillover)은 실험에 사용되는 시약과 동일해야 합니다. 유사한 fluorochromes인 FITC, Alexa Fluor™ 488, GFP 등도 방출 스펙트럼이 다르기 때문에 각 dye 마다 서로 다른 spillover 값을 가질 수 있습니다. PI, 7-AAD, BD Horizon™ Fixable Viability Stains와 같은 live/dead dyes 에도 적용 가능합니다.
Tandem dye 별로 가지는 spillover 값이 상당히 다릅니다. 따라서 tandem dye에 대해서는 로트 별 compensation을 권장합니다. 실험에서 각 tandem dye에 대한 compensation control이 있어야 합니다.
샘플을 준비한 것과 동일한 방식으로 compensation control을 취급하는 것을 권장합니다. 여기에는 동일한 날짜에 준비, 동일한 시약 사용(예: 동일한 perm buffer, compensation control로 Horizon™ Brilliant Stain Buffer (BSB의 사용), 동일한 인큐베이션 및 보관시간 등이 포함됩니다. 동일한 시약을 사용하여 다른 시간에 생성된 매트릭스는 sample compensation에 영향을 주는 차이를 보일 수 있습니다.
네. Dye간 상호작용으로 인한 staining artefacts를 제거하기 위해 동일 실험에서 두 개 이상의BD Horizon Brilliant™ Dyes를 사용하는 경우 BD Horizon™ Brilliant Stain Buffer (BSB)를 사용합니다. Multi-color 실험에서 BSB를 사용하는 경우 single-color compensation control tube 에서도 BSB를 사용하는 것이 가장 좋습니다. Buffer는BD® CompBead Particles와 호환되지만, 다른 벤더사가 제공하는 compensation bead로는 테스트 되지 않았습니다.
BD Horizon ™ Brilliant Stain Buffer 또는 BD Horizon ™ Brilliant Stain Buffer Plus는 둘 이상의 BD Horizon Brilliant ™ 시약을 사용할 때 multicolor immunofluorescent staining 및 유세포 분석에 사용해야합니다. 인간 전혈은 BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) 마우스 항 인간 CD4 및 BD Horizon ™ BV711 마우스 항 인간 CD19 항체로 염색되었습니다. 적혈구는 BD FACS ™ Lysing Solution (Cat. No. 349202)으로 용해되었습니다. CD4 대 CD19의 상관발현을 보여주는 two-color 유세포 분석 contour plot은 온전한 림프구의 전방 및 측면 광산란 특성을 가진 gated event에서 파생되었습니다. BD Horizon ™ Brilliant Stain Buffer (Cat. No. 563794/566349, 오른쪽 plot)이 존재할 때 세포를 staining하면 Brilliant Stain Buffer없이 염색한 세포와 비교할때 주요 림프구 집단을 예상되는 형광 염색 패턴 (점선)으로 복원할 수 있습니다(왼쪽 plot). BD LSRFortessa™ Cell Analyzer System 을 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다.
형광 parameter에 대한 voltage는 compensation acquisition 중에는 반드시 유지되어야 하지만 FSC와 SSC는 변경할 수 있습니다. FCS/SSC plot에서 동일한 위치에 있지 않은 cell과 bead를 결합할 때 특히 유용합니다.
일반적으로 compensation 생성을 위해 cell을 사용하는 경우 universal negative를 사용하여 negative population fluorescence를 정의합니다. Compensation control로 single-stained cell을 포함하는 튜브에서 Cell과 bead를 결합할 때 각 형광 히스토그램에서 negative population 주변의 autointerval gate(P3)를 생성합니다. Bead를 사용하는 경우 7-AAD를 제외한 모든 형광색소, cell을 사용하는 경우 viability dyes에 적용되기도 합니다.
계산된 compensation은 positive compensation control의 밝기까지만 보정됩니다. Compensation control이 off scale인 경우 PMTV를 조정하기 보다는 control에 추가되는 항체의 양을 줄이는 것이 좋습니다.
이들 dye는 BD® CompBead Particles과 최적으로 작동하지 않으며 BD® CompBead Particles로 평가한 염료의 spillover 값은 cell에 대한 정확한 compensation을 제공하지 않을 수도 있습니다. Single-stained cellular control이 보다 정확한 compensation 결과를 제공할 수 있습니다.
