세포 분리는 강력한 기술이며 기본 및 임상 연구 응용 분야에 꼭 필요한 실험법입니다. 생물학적 세포 집단의 이질성이 존재하기 때문에 각각의 세포 유형을 분리할 필요가 있는 경우도 있습니다. 전통적으로 세포 분리는 정전기력 또는 자기력에 대한 접착력, 크기, 밀도 또는 친화력과 같은 세포의 물리적 특성을 기반으로 수행되었습니다. 표면 항원의 발현과 같은 생화학적 특성도 세포 분리에 사용됩니다.
자성세포분리란 무엇이며 어떠한 방법으로 진행되나요?
자성세포 분리 기술은 자기 bead-tagged 항체로 세포 표면 marker를 표지할 수 있는 잠재력과 자기장력을 활용하여 표지된 입자를 이동시킵니다 .1 자기력에 의해 제어된 이동(자기 영동)은 세포 분리에 매우 중요하며, magnetic activated cell sorting (MACS)의 기본입니다. Tube 기반 또는 column 기반으로도 세포 분리가 가능합니다.2
Tube 기반 자성 분리 방법에서는 자기적으로 표지된 세포의 현탁액을 자석에 놓아 표지된 세포가 이동하여 분리되도록 합니다.
Column 기반 자성 분리 방법에서는 자기적으로 표지된 세포의 현탁액이 자석내 column을 통해 분리되어 표지된 세포를 capture한 다음 분리할 수 있습니다.
세포의 positive selection vs negative selection
보존되거나 격리되는 항목에 따라 두 가지 유형의 선택이 가능합니다.
- 세포 positive selection
- 세포 negative selection
세포의 positive selection이란 무엇이며 중요한 이유는 무엇인가요?
Positive 선택은 표적 집단으로 수집해야 하는 세포를 선택합니다. 이 방법은 표면에 공유 결합된 관심대상 subpopulation을 표적으로하는 항체가 있는 자성입자를 사용합니다. 일단 자석 안에 놓이면 표적 세포는 자석쪽으로 이동하여 자기장내에 유지되고 표지 되지 않은 세포는 제거하고 버립니다. 그런 다음 표적 세포를 수집하여 자기장에서 제거한 후 원하는 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.
Positive selection은 선택된 세포의 순도, 회복 및 생존력과 관련하여 우수한 결과를 보입니다. 그러나 선택되는 세포 유형 및 입자에 의해 표적화되는 표면 항원에 따라 positive selection은 세포를 활성화시키거나 기능적으로 변경시킬 수 있습니다. 활성화 가능성은 낮지만 자기입자에 의한 활성화는 purified 및 unstimulated cell이 필요한 경우 문제가 될 수 있습니다. 이 경우 세포 분리를 위해 negative selection을 고려해야 합니다.
세포의 negative selection이란 무엇이며 중요한 이유는 무엇인가요?
Negative selection은 필요하지 않은 세포를 자기적으로 분리하는 반면, 세포의 표적 집단은 세포 분류와 같은 다운스트림 적용 전에 흡인 및 수집할 수 있습니다.
고갈 또는 negative selection에 의한 enrichment는 높은 수준의 순도와 표면에 결합된 항체 또는 입자가 없는 세포 집단이 필요한 연구 분야에 사용됩니다.
이 절차에서 모든 원치 않는 세포는 먼저 발현된 항원에 대한 monoclonal antibodies 를 포함하는 cocktail로 표지됩니다. 결합되지 않은 항체를 세척한 후 2 단계 시약을 사용하여 이러한 세포를 표지합니다. 표지된 세포는 자석으로 이동하여 현탁액에 수집할 pure, untouched subpopulation을 남깁니다. 원치 않는 세포 집단의 상당수(> 95 %)는 negative selection을 통해 제거할 수 있습니다.1
Negative selection을 사용한 enrichment는 downstream single-cell multiomic 분석에 권장됩니다. 이러한 pre-enrichment는 세포의 manipulation을 최소화하는 것을 지원합니다.
분류 전 Pre-enrichment
분류 전 enrichment는 특히 매우 rare한 세포 집단의 경우 더 빠르고 더 나은 분류 결과를 얻는 데 매우 유용합니다. 이 절차에서 관심 대상 세포는 먼저 negative selection을 통해 enriched됩니다. 이 프로세스 통해 원치 않는 세포의 20–80 %를 제거할 수 있으므로 관심있는 세포 집단을 더 빠르고 효율적으로 분류할 수 있습니다.
자성 세포 분리를 활용하기 위한 주요 고려 사항은 무엇입니까?
세포 분리 결과를 결정하는 요인은 세가지입니다.
- 표적세포 순도
- 표적세포 회복
- 세포 생존력
표적세포 순도
이종 집단에서 비표적 세포와 수집된 표적 세포의 백분율로 수집된 표적 cell fraction의 순도를 결정합니다.
표적세포 회복
원래 세포 현탁액의 총 표적 세포 수와 분류 후 얻은 표적 세포의 백분율로 회복을 결정합니다.
세포 생존력
생존율은 살아있는 세포의 백분율을 말하며 분리후 세포 품질을 나타낼 수 있습니다.
참고문헌
- Plouffe BD, Murthy SK, Lewis LH. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. Rep Prog Phys. 2015;78(1):016601. doi: 10.1088/0034-4885/78/1/016601
- Tomlinson MJ, Tomlinson S, Yang XB, et al. Cell separation: Terminology and practical considerations. J of Tissue Eng. 2013;4:2041731412472690. doi: 10.1177/2041731412472690
BD Biosciences 세포 자성분리 제품 포트폴리오
BD Biosciences는 자성 세포 분리를 위한 다양한 시약과 강력한 자석을 제공합니다.
당사의 포트폴리오에는 세포의 negative 및 positive selection을 위한 다양한 자성 분리 시약이 포함되어 있습니다. B 림프구, CD4 및 CD8 T 림프구, NK cell 및 특정 유형의 수지상 세포를 풍부하게 하는 시약을 사용할 수 있습니다.
BD Biosciences 자성분리 워크플로우 프로토콜
| 단계 | Positive selection (+) | Negative selection(–) |
|---|---|---|
| 1 | BD IMag ™ 입자가 표시된 세포 현탁액을 BD IMag ™ Magnet 위에 놓습니다. | BD IMag™ Particle- 표지 세포 현탁액을 BD IMag™ Magnet위에 높습니다. |
| 2 | Positive 부분을 포함하는 튜브를 제거합니다. | Negative 부분을 포함하는 상층부를 제거하고 올바른 라벨이 붙은 튜브에 놓습니다. |
| 3 | Positive 부분을 resuspend하고 BD IMag ™ Magnet.에 다시 놓습니다. | Positive 부분을 resuspend하고BD IMag™ Magnet위에 다시 올려 둡니다. |
| 4 | Positive 부분을 포함하는 튜브를 제거합니다. | Negative 부분을 제거하고 2단계에서의 negative 부분과 pooling 합니다. |
| 5 | Positive 부분을 resuspend하고 BD IMag ™ Magnet에 다시 놓습니다. | Positive 부분을 resuspend하고BD IMag™ Magnet위에 다시 올려 둡니다. |
| 6 | Positive 부분을 제거하고 사용을 위해 세포를 resuspend 합니다. | Negative 부분을 제거하고 2단계, 4단계에서의 negative 부분과 pooling 합니다. |
| 7 | 통합된 negative 부분을 BD IMag ™ Magnet에 올려 놓습니다. | 통합된 negative 부분을 BD IMag ™ Magnet에 올려 놓습니다. |
| 8 | 잔여 positive 부분을 제거하고 폐기합니다. | 남아있는 두번 농축된 부분을 제거하고 올바른 라벨이 붙은 튜브에 넣어 사용합니다. |
+ 와 – 는 각각 positive 및 negative selection 프로세스를 나타냅니다.
BD Biosciences 자성분리 시약을 이용하여 생성된 샘플 데이터
CD25 와 CD69 positive 또는 negative selection 후 CD25와 CD69 활성화 marker의 발현
BD IMag™ Mouse CD4 입자인–DM , BD IMag™ Mouse CD4 T Lymphocyte Enrichment세트–DM을 각각 사용하여 CD4 세포의 positive selection 또는 negative selection (enrichment) 후 CD25 및 CD69의 활성화 marker 발현
Enrichment 프로토콜의 유연성을 보여주는 데이터
기본 농축 프로토콜을 다양한 실험 요구에 맞게 조정할 수 있는 방법과 positive selection과 enrichment를 결합하여 uncommon cell subpopulation을 분리하는 방법을 보여줍니다.
