Immunohistochemistry

Overview

Immunohistochemistry (IHC)는 특정 항체를 사용하여 조직 샘플에서 특정 항원을 측정하는 실험법입니다. IHC는 암 조직의 병리학적 평가, 종양의 예후 예측, 치료에 대한 반응 예측, 감염 유무 확인 등 수많은 연구 분야에서 적용됩니다.¹IHC를 이용하여 항원의 유무 측정 이외에도 항원 분포 및 위치를 확인할 수 있습니다.

IHC 원리

특정 조직은 먼저 고정, paraffin embedded, 냉동 보관 및 sectioning됩니다. 보관된 섹션은 항원 retrieval을 위한 처리 (paraffin embedded 섹션의 경우 탈파라핀화, 냉동 보관 한 섹션의 경우 가열)를 한 다음 항원에 특정 항체를 사용하여 immunostained 합니다. 웨스턴 블로팅 또는 ELISA와 마찬가지로 IHC는 직접적인 방법과 간접적인 방법이 있습니다. (하나의 항체 또는 1 차 및 2 차 항체를 조합하여 사용). 일반적으로 horseradish peroxidase (HRP)와 알칼리성 포스파타제(AP)와 같은 효소를 사용하여 측정합니다. 결과는 현미경으로 관찰합니다.

Immunocytochemistry, immunohistochemistry, immunofluorescence의 차이는 무엇인가요?

Immunohistochemistry 원리는 immunocytochemistry (ICC)의 원리와 유사하지만IHC는 조직 샘플을 사용하고ICC는 세포를 사용하는 차이가 있습니다.

Immunocytochemistry (ICC) 및 immunohistochemistry (IHC)은 측정을 위해 항원의 면역 표지를 사용하고 immunofluorescence 을 사용합니다. immunocytochemistry와 immunofluorescence는 같은 의미로 사용되는 경우도 종종 있습니다.

ICC와 IHC 두 기술 모두 측정을 위해 immunofluorescence을 사용합니다. 효소기반의 측정도 가능합니다(예: 3,3’-diaminobenzidine (DAB)의 사용).

참고문헌

Duraiyan J, Govindarajan R, Kaliyappan K, Palanisamy M. Applications of immunohistochemistry. J Pharm Bioallied Sci. 2012;4(Suppl 2):S307-S309. doi: 10.4103/0975-7406.100281

IHC 샘플 전처리

IHC를 위한 샘플 전처리

먼저 조직 샘플을 준비한 후 조직 구조를 가능한 그대로 유지하고 항원을 수집 당시 상태에 최대한 가깝게 유지하기 위해 보존하는 것이 중요합니다. 전처리 방법은 시간 경과에 따른 샘플 보존 및 항원 측정에 영향을 미칩니다.

고정제의 선택은 검출될 항원 및 분석 유형(예: 형태 또는 발현)에 따라 달라집니다.

조직 고정

조직 샘플 보존을 위해 immunohistochemistry에서 4% paraformaldehyde (PFA) 를 일반적으로 사용합니다. 이 고정 방법을 사용하면 조직 구조를 잘 보존할 수 있지만 항원 에피토프의 형태가 변화되어 측정에 영향을 줄 수 있습니다. 포름알데히드에 의한 에피토프 마스킹으로 인해 항원 retrieval 에이전트는 일반적으로 항원 특이성을 높이기 위해 사용됩니다.

포름알데히드 대신 아연과 같은 순한 고정제를 paraffin-embedded section에 사용할 수 있습니다. IHC 샘플 고정에 포름알데히드 및 아연 이외에도 알코올 또는 아세톤을 사용할 수 있습니다.

조직 임베딩(embedding)

조직 샘플이 고정된 후 조직 샘플은 파라핀이 들어있어 조직 sectioning이 가능합니다. Sectioning을 위한 블록을 만들기 위해 보통 파라핀이 사용됩니다. 다른 조직 전처리 방법은 샘플의 급속 냉동입니다. 급속 냉동은 신속하게 항원 에피토프를 보존할 수 있지만, 냉동 중에 형성된 얼음 결정으로 조직 구조가 변경될 수 있습니다.

조직 섹셔닝(sectioning)

조직 sectioning은 immunohistochemistry 실험을 위한 staining ground 로 사용될 슬라이스가 가능합니다. Paraffin-embedded tissues 는 sectioning을 위해 마이크로톰을 필요로 하는 반면 냉동 조직은 저온 유지 장치를 사용하여 sectioning 합니다.

BD Pharmingen™ IHC Zinc Fixative 는 항원 및 조직 형태를 그대로 유지하는 약한 고정제로 특히 백혈구 마커 검출에 적합하고 고정된 조직의 포름알데히드 보존 구조를 생성합니다. BD Pharmingen ™ IHC Zinc Fixative와 BD Pharmingen ™ Retrievagen A (pH 6.0) 및 Retrievagen B (pH 9.5) 솔루션을 결합하면 일부 에피토프에 대한 항체 반응성이 더욱 향상됩니다.

IHC를 위한 항원 retrieval 방법

두 가지 주요 항원 retrieval 방법을 사용하여 embedding으로 인해 항원 에피토프의 특이성을 높여, 에피토프 면역 반응성을 증가시킵니다.¹

Protease-induced epitope retrieval (PIER)

효소 retrieval로도 알려진 protease-induced epitope retrieval (PIER)은 프로테아제 화학 반응을 이용하여 조직 고정 과정에서 생성된 교차 연결을 되돌립니다. 이 방법은 일반적으로 복원하기 어려운 에피토프를 retrieve하는데 사용됩니다. 중성 pH 정도의 효소 buffer solution(예: 트립신, 프로테아제 K)를 이용하는 방법입니다. 비특이적 효소 반응이 있는 강력한 retrieval방법이기 때문에 과도하게 배양하는 경우 특정 에피토프와 조직 구조를 손상시킬 수 있습니다.

Heat-induced epitope retrieval (HIER)

Heat-induced epitope retrieval (HIER) 은 열과 가압에 의존하여 항원성 에피토프를 retrieval합니다. PIER는 neutral buffer solutions 을 사용하는 반면 HIER에서는 표적 항원에 따라 다양한 pH 범위를 사용할 수 있습니다.

BD Biosciences는 BD Pharmingen ™ IHC Zinc Fixative로 고정된 조직과 함께 사용하기에 적합한 두 가지 효과적인 항원 retrieval 시약 인 BD Pharmingen ™ Retrievagen A (pH 6.0) 및 Retrievagen B (pH 9.5) 솔루션을 제공합니다.

참고문헌

Ireka Y, Agustina H, Aziz A, Hernowo BS, Suryanti S. Comparison of fixation methods for preservation cytology specimens of cell block preparation using 10% neutral buffer formalin and 96% alcohol fixation in E-cadherin and Ki-67 immunohistochemical examination. Open Access Maced J Med Sci. 2019;7(19):3139-3144. doi: 10.3889/oamjms.2019.452.

IHC 측정 방법

직접 및 간접 immunohistochemistry 방법

아래 내용은 두 가지 주요 immunostaining 방법에 대한 내용입니다.

직접방법

직접 immunohistochemistry 은 single-conjugated antibody를 이용하여 특정 항원 에피토프를 측정합니다. 발현양이 많은 항원 측정에 사용되는 방법입니다.

간접방법

간접 immunohistochemistry 은 두 단계의 항체 staining을 사용합니다. 특정 항원에 대한 1차 항체가 먼저 항원에 결합된 다음 1 차 항체에 접합된 2 차 항체를 사용하여 현미경으로 측정할 수 있습니다. 간접 immunohistochemistry는 발현양이 중저(mid to lowly expressed) 항원 측정에 많이 사용됩니다.

항원 발현 양, 분포, 조직 샘플 처리 방법 등 여러 요인에 따라 사용되는 방법이 다릅니다.¹

IHC 측정 방법

색상변화 특성을 이용한 측정

Colorimetric 또는 chromogenic immunohistochemistry에서는 효소와 그 substrate 반응을 이용하여 반응 부위에 국한되는 발색성 침전물을 생성합니다. horseradish peroxidase (HRP)와 알칼리성 포스파타제 (AP)가 주로 사용되는 효소 측정 방법입니다. BD Biosciences는 BD Pharmingen ™ DAB Substrate Kit 및 BD Pharmingen ™ AEC Substrate Kit와 같이 효소와 함께 사용할 수 있는 다양한 substrate를 제공합니다.

Fluorescence 측정

Fluorescence immunohistochemistry 은 특정 파장의 빛에 의해 excited 되고 특정 파장대의 형광을 방출하는 형광 dye가 결합된 항체를 사용하여 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다. BD Biosciences는 IHC를 위한 다양한 fluorescence-coupled 이차 항체를 제공합니다.

IHC staining 품질 향상

Immunohistochemistry staining을 통해 정확한 결과를 확인하기 위해서는 실험을 신중하게 계획하고, 조직을 잘 수집하고 특정 항원 측정에 최적화된 옵션을 선택하여 샘플을 staining해야 합니다.

신호 증폭

단일 항원의 multiple epitopes를 인식할 수 있는 polyclonal antibodies를 사용하여 신호를 증폭할 수 있습니다. 다중 복합체와 결합된 2 차 항체는 물론 폴리머 기반 방법, avidin-biotin complex (ABC) 방법 및 labeled-streptavidin biotin (LSAB) 방법 등도 이용 가능합니다.

비특이적 결합 감소

BD Bioscience는 비특이적 결합을 줄이고 signal to noise ratio를 높이기 위해 blocking solution을 제공합니다. IHC 용 BD Pharmingen ™ Antibody Diluent와 같이 staining 중 background noise를 확인하는 시약도 사용할 수 있습니다.

항체를 사용하여 생성된 샘플 IHC 데이터

항체 및 시약 이외에도 BD Biosciences는 검증된 IHC 프로토콜도 제공합니다.

참고문헌

Magaki S, Hojat SA, Wei B, So A, Yong WH. An introduction to the performance of immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 2019;1897:289-298. doi: 10.1007/978-1-4939-8935-5_25

연구용입니다. 진단용 또는 치료용으로 사용할 수 없습니다.