줄기세포 연구

Overview

자가 재생하고 다른 유형의 특수 세포로 분화하는 줄기세포의 놀라운 능력은 여러 치료 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있습니다. 이러한 능력은 혈액, 피부 및 장과 같이 지속적으로 재생되는 조직의 보존에 중요합니다. 줄기세포는 배아(배아 줄기세포)에서 성인기(성인 줄기세포)까지의 모든 발달 단계에서 발견됩니다. 발달 과정에서 여러 유형의 줄기 세포가 나타나 조직 항상성에 적극적으로 관여합니다.¹

줄기 세포 및 줄기 세포 niche

다능성, 과능성 및 단능성 줄기 세포를 포함한 다양한 유형의 줄기 세포가 있습니다. 배아 줄기세포 (ESC) 및 유도 만능 줄기세포 (iPSC)와 같은 다능성 줄기세포는 줄기세포 연구에 광범위하게 사용됩니다. ESC는 배양에서 배아 발달의 세 가지 germ layers 로 분화할 수 있습니다. 주요 전사 인자를 사용하여 성숙한 분화 세포 (또는 체세포)를 조혈 세포 (HSC)를 비롯한 여러 유형의 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기 세포로 유도할 수 있습니다.²

Diagram detailing embryonic stem cell differentiation process.

배아 줄기세포 분화

다능성 중간엽 간질 세포로도 정의되는 중간엽 줄기세포 (MSC)는 뼈와 연골과 같은 중간엽 조직의 predecessor입니다. 그들은 dendritic cell의 항원 제시 활동, NK cell의 세포 독성, B cell에 의한 항체 생산과 같은 여러 면역 기능을 조절합니다. 강력한 면역 억제 기능으로 인해 MSC 는 염증 및 자가면역 질환 치료에서 세포 기반 접근법의 잠재적인 후보군입니다. 여러 연구에서 MSC 가 관련되지 않은 조직의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력이 있다는 점이 시사되었습니다.³ MSC와 그 파생물은 골 주위 세포, 골수 간질 세포 및 골 계통 세포와 같이 HSC niche를 구성하는 여러 유형의 세포를 포함합니다. MSC는 여러 성인 조직(골수, 말초 혈액, 지방 조직) 또는 태아 조직에서 분리할 수 있으며 세포 치료 연구 및 재생 의학에 활용되고 있습니다.⁴

Diagram detailing pluripotent stem cell differentiation process.

유도된 다능성 줄기세포의 분화.

줄기세포 niche

줄기 세포 niche는 줄기세포가 재편성되고 스스로 재생되고 미분화 상태를 유지하는 육성 환경입니다. 적절한 세포 신호 전달을 통해 줄기세포는 niche로부터 줄기세포를 필요로 하는 지역으로 이동할 수 있습니다. 뇌의 뇌실하 및 과립하 영역(SVZ 및 SGZ), 모낭, 소장 및 골수를 포함한 많은 줄기 세포 niche가 전신에서 확인되었습니다.^{5, 6, 7}

Diagram showing the process for self-renewing HSC propogation.

줄기세포 연구를 위한 multicolor유세포 분석

유세포 분석은 확립된 marker를 기반으로 세포 subset의 이질성을 모니터링하기위한 강력한 도구입니다. 세포 표면 또는 세포 내 biomarker에 특이적인 형광 색소 접합 항체를 사용하여 줄기세포가 다능성을 유지했는지 확인할 수 있습니다. 줄기세포는 세 가지 기본 배아층과 조직으로 분화되기 때문에 항체로 변화하는 발현 패턴을 모니터링 할 수 있습니다. BD Lyoplate™ Cell Surface Marker screening panel은 이러한 세포를 심도있게 탐색하는 데 사용할 수 있는 표면 marker signature를 발견할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

BD Biosciences는 이질적인 줄기세포 집단의 특성분석, 분석 및 분류하기 위해 줄기세포 연구를 지원하는 고품질 항체, 키트 및 칵테일, buffer, 프로토콜 및 장비를 포함한 다양한 도구 세트를 제공합니다.

참고문헌

Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):68. doi:10.1186/s13287-019-1165-5
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024
Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Rev Immunol. 2008; 8(9):726-736. doi: 10.1038/nri2395
Vizoso FJ, Eiro N, Cid S, Schneider J, Perez-Fernandez R. Mesenchymal stem cell secretome: Toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. Int J Mol Sci. 2017;18(9):1852. doi: 10.3390/ijms18091852
Boulais PE, Frenette PS. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 2015;125(17):2621-2629. doi:10.1182/blood-2014-09-570192
Ferraro F, Celso CL, Scadden D. Adult stem cels and their niches. Adv Exp Med Biol. 2010;695:155-168. doi:10.1007/978-1-4419-7037-4_11
Cable J, Fuchs E, Weissman I, et al. Adult stem cells and regenerative medicine-a symposium report. Ann N Y Acad Sci. 2020;1462(1):27-36. doi:10.1111/nyas.14243

Surface Staining

Surface staining

BD Biosciences는 표면 단백질 에피토프의 발현을 변경하지 않고 줄기세포를 전처리할 수 있는 효과적인 솔루션을 제공합니다.

샘플 전처리

줄기세포는 부착하는 경향이 있으며 3 차원 구조로 성장할 수 있습니다. 유세포 분석을 위한 single-cell suspension을 준비하려면 효소 분해 (BD^® Accutase™ Cell Detachment Solution 또는 트립신 사용) 또는 기계적 scrapping이 가능합니다. 효소 방법은 분해 과정에서 일부 단백질 에피토프를 절단하거나 변형하여 항체 표지를 방지할 수 있으므로 측정되는 각 표면 marker에 대한 평가가 이루어져야 합니다. BD^® Accutase ™ Solution은 트립신 및 scrapping 보다 널리 적용되는 경향이 있습니다.

Monoclonal antibodies

세포가 수확되고 buffer가 제거되면 세포는 항체로 염색될 준비가 됩니다. BD Biosciences는 실험 설계의 유연성을 위해 다양한 형광 색소에 접합된 수백 개의 줄기세포 마커에 대한 광범위한 항체 시약 제품을 제공합니다. Rare 이벤트 및 저밀도 항원 분석을 위해 BD Horizon Brilliant Violet™ Dyes는 밝기와 resolution을 높일 수 있습니다. 사용 편의성을 위해 BD Stemflow™ Kit and Cocktails에는 줄기세포 분석 또는 분류를 위한 표준 항체 panel이 포함되어 있습니다.

선별된 줄기세포 및 파생물의 대표적인 marker

Human Markers	Mouse Markers	BD Stemflow™ or Other Kit	Cat. No.
Pluripotent Stem Cells (ESCs and iPSCs)
Positive: Alkaline Phosphatase, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-81, TRA-1-60 Negative: SSEA-1	Positive: SSEA-1	Human iPSC Sorting and Analysis Kit	562626
Human Pluripotent Stem Cell Sorting and Analysis Kit	560461
Human and Mouse Pluripotent Stem Cell Analysis Kit	560477
Hematopoietic Stem Cells (HSCs)
Positive: CD34, CD49f, CD90 Negative: CD38, CD45RA, Lineage*	Positive: CD150, c-Kit, Sca1 Negative: CD34, CD41, CD48, Lineage	BD Pharmingen™ Human Lineage Cocktail 4	562722
Mouse Hematopoietic Stem Cell Isolation Kit	560492
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)
Positive: CD44, CD73, CD90, CD105, CD146, CD271 Negative: CD11b, CD19, CD31, CD34, CD45, CD144, HLA-DR	Positive: CD29, CD44, CD90, CD105, CD106, Sca-1 Negative: CD11b, CD31, CD45, Ter-119	Human MSC Analysis Kit	562245
Human Mesenchymal Stem Cell Lineage Antibody Cocktail	562530
Neural Stem Cells (NSCs)
Positive: CD15^mid, CD24, CD184 Negative: CD44, CD271
Neurons
Positive: CD15^low, CD24 Negative: CD44, CD184	–	Human Neural Cell Sorting Kit	562271
Cancer
CD15, CD24, CD34, CD44, CD45, CD49f, CD166, CD326, CD338, Her-2/Neu, Lgr5	–	–	–

* Human lineage (lin) markers: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a

조혈 줄기세포 표현형

조혈 시스템 세포는 표면 marker 발현과 관련하여 잘 특성화되며, 이는 조혈 중에 세포의 subset를 분리하고 특성분석 하는데 자주 이용됩니다. 이러한 조혈 세포의 근원인 조혈줄기세포 (HSC)는 정상적인 골수 기능을 보충하는 데 사용될 수 있기 때문에 현재 줄기세포 생물학에서 중점적으로 다루고 있는 분야입니다.

역사적으로, 세포 pool 중에서 HSC는 CD90 및 CD34¹ 를 발현하는 lineage-negative세포로 확인되었습니다. 자가갱신이 가능한 장기 HSC (LT-HSC) pool을 풍부하게 하는 추가 marker에는 CD38,² CD45RA,³ 및 CD49f⁴ 가 포함됩니다. 보고된 바에 따르면 Lin–CD34 + CD38–CD90 + CD45RA–CD49f + 표현형을 가진 세포의 약 10 %는 마우스 모델에서 장기적인 repopulating 기능을 제공할 수 있습니다. ⁴

Data sets showing LT HSC gating strategy and various test results.

참고문헌

Baum CM, Weissman IL, Tsukamoto AS, Buckle AM, Peault B. Isolation of a candidate human hematopoietic stem cell population. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(7):2804-2808. doi: 10.1073/pnas.89.7.2804
Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(10):5320- 5325. doi: 10.1073/pnas.94.10.5320
Majeti R, Park CY, Weissman IL. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 2007;1(6):635-645. doi: 10.1016/j.stem.2007.10.001
Notta F, Doulatov S, Laurenti E, Poeppl A, Jurisica I, Dick JE. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 2011;333(6039):218-221. doi: 10.1126/science.1201219

Intracellular Staining

세포내 staining

세포 내 staining을 사용하면 유세포 분석의 속도와 통계적 관련성을 세포 내부의 기능성 단백질 조사로 확장할 수 있습니다. 특정 분화 경로를 따라 움직이는 세포의 중요한 시점, 마커 및 비율을 식별하기 위해 표면 염색과 함께 사용할 수 있는 방법입니다. 세포내 staining 프로토콜은 항체가 세포질과 핵에 접근할 수 있도록 세포를 고정하고 투과하는 과정을 담고 있습니다. 고정은 세포를 효과적으로 죽이기 때문에 세포내 염색은 live-cell 분류와 함께 사용할 수 없습니다.

샘플 전처리

세포 내 staining의 경우 표면 염색과 마찬가지로 효소 또는 기계적 방법을 사용하여 single-cell suspension을 준비해야합니다. BD® Accutase™ 솔루션은 세포 응집을 방지하고 동시 분석을 위해 표면 단백질을 보존할 수 있기 때문에 권장되는 솔루션입니다. 선택적 표면 staining 후 항체가 들어갈 수 있도록 세포를 고정하고 투과화해야합니다. 그 다음 세포를 세포 내 항원에 대한 형광 표지 항체로 염색하고 유세포 분석기에서 분석합니다.

투과성 및 염색 조건을 최적화하기 위해 당사는 주요 줄기세포 전사 인자의 측정을 위한 여러 키트를 개발했습니다. 이 키트에는 줄기세포를 특성을 분석하고 다양한 계통으로의 분화시키기 위한 최적화된 항체 및 buffer 시스템이 포함되어 있습니다.

Cell Type	Intracellular Markers	BD Stemflow™ Kit	Cat. No.
Embryonic stem cells (ESCs) Induced pluripotent stem cells (IPSCs)	Nanog, Oct 3/4, Sox2	Human Pluripotent Stem Cell Transcription Factor Analysis Kit	560589
Mouse Pluripotent Stem Cell Transcription Factor Analysis Kit	560585
Neural stem cells (NSCs)	Nestin, Pax6, Sox1, Sox2	Human Neural Lineage Analysis Kit	561526
Astrocytes	GFAP	Human Neural Lineage Analysis Kit	561526
Neurons	Doublecortin	Human Neural Lineage Analysis Kit	561526
Early pancreatic endoderm	FoxA2, Pax6, Pdx1, Sox17	Human Definitive and Pancreatic Endoderm Analysis Kit	562496
Late pancreatic endoderm	NeuroD1, Nkx6.1
Cardiac	cTNI, GATA4, Islet-1, Myosin Heavy Chain
Hepatic	AFP, GATA4

줄기세포 분화

인간 다능성 줄기세포가 다양한 세포 계통으로 분화하는 능력은 발달 생물학의 핵심 주제이며 재생의학 및 세포 치료에 적용됩니다. 다능성 세포가 다른 계통으로 분화함에 따라 전사 인자 및 기타 단백질의 발현이 변할 수 있습니다. Multiparametric flow cytometry는 관심있는 marker를 발현하는 세포의 상대적인 수를 결정할 수 있는 훌륭한 방법이며 분화 프로토콜 및 분화 잠재력을 최적화, 정량화 및 비교하는 데 사용할 수 있습니다.

예를 들어, 포유류 배아 발달에서 최종 내배엽은 간, 췌장 및 장을 생성합니다.¹ 최종 내배엽으로의 lineage specification 과정에서 전사 인자 Sox17 및 FoxA2의 수준이 증가하는 반면 Nanog와 같은 다능성 marker는 감소합니다.²

Data set showing day zero and day 3 results for FoxA2 and Nanog tests.

신경 줄기 세포에서 신경 계통으로의 분화는 multicolor flow분석을 사용하여 모니터링할 수도 있습니다. 신경 줄기 세포 (NSC)는 뉴런으로 분화함에 따라 점차적으로 Nestin을 더 적게, 초기 뉴런 마커 더블 코르틴 (DCX)을 더 많이 발현합니다. Nestin을 계속 발현하는 세포의 subpopulation은 CD44를 발현하는 아교 세포 집단으로 나타납니다.

신속한 marker screening

유세포 분석 기술의 리더인 BD Biosciences는 스크리닝 노력을 효율적으로 지원할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

줄기세포 생물학이 직면한 주요 과제는 배양 및 분화의 이질적인 특성입니다. 이후 실험에서 사용하기 위해 정제할 생존 세포를 분류하려면 관심있는 세포의 표면 특성을 알아야합니다. 서로 다른 유형의 관련 세포가 마커를 공유할 수 있기 때문에 연구자들은 각각에 대해 고유한 다중 marker signature를 찾아야 하며, 다른 마커는 특정 유형의 세포의 subpopulation을 구별하는 데 유용할 수 있습니다.

Data sets showing CD44 and DCX results after 0, 14, and 27 day periods.

BD Lyoplate™ Cell Surface Marker Screening Panels 은 유세포 분석 또는 세포 이미징을 통해 수백 개의 인간 또는 마우스 세포 표면 marker에 대한 줄기세포 및 그 유도체를 프로파일링 하기 위한 포괄적이고 효율적인 솔루션을 제공합니다. 세포 표면 프로테옴을 해독하면 연구자들이 기능 연구, 약물 스크리닝, 생체 내 동물 연구 및 세포 치료 연구를 위해 이종 집단에서 표적 세포를 분석하고 분리하는 전략을 정의할 수 있습니다.

각 panel에 있는 수백 개의 monoclonal antibodies는 세포 분석에 사용할 수 있는 가장 비용 효율적인 스크리닝 도구 중 하나입니다. 보다 표적화 된 대규모 실험으로의 전환을 단순화하기 위해 screening panel에 포함된 모든 항체는 BD Biosciences 카탈로그에서 제공합니다.

인간(Cat. No. 560747) 및 마우스 (Cat. No. 562208) panel은 모두 3 개의 plate를 포함합니다. 각 well에는 하나의 세포 표면 마커 또는 아이소타입 control에 대한 동결 건조, 정제된 항체가 포함되어 있습니다. 재구성 후 세포 샘플을 정제된 항체로 염색하고 panel에 포함된 검출 시약을 추가합니다. 최종적으로 유세포 분석 또는 이미징을 통해 샘플을 분석합니다.

워크플로우를 단순화하면서 유연성을 제공하기 위해 open well을 사용하여 추가 마커를 포함할 수 있어 panel 확장이 가능합니다. 강력한 BD Biosciences 분석 도구로 데이터 마이닝 및 히트맵 생성이 수월해집니다.

BD Lyoplate ™ Panel을 사용한 유세포 분석과 이미지 스크리닝에 대한 고려 사항

Property of sample	Flow cytometry	Imaging
Suspension cells	X
Rare cell populations	X
Subpopulation analysis Co-staining with multiple markers	X
Reporter lines	X	X
Specific morphology changes		X
Limited number of cells		X

참고문헌

Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.  2008;132(4):661-680. doi: 10.1016/j.cell.2008.02.008
D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23(12):1534-1541. doi: 10.1038/nbt1163

Screening

신경집단 screening

다능성 줄기세포에서 파생된 신경 세포 집단은 인간의 질병과 발달을 연구하는 데 중요합니다. 다능성 줄기세포는 자가재생 NSC로 분화될 수 있으며, 이는 이질적인 뉴런 및 신경 교집단으로 더 분화될 수 있습니다.¹ 이러한 각 세포 유형에 대한 surface marker signature를 식별하는 것이 추가 연구의 핵심입니다.

아래 예시에서 BD Lyoplate™ Human Cell Surface Marker Screening Panel (Cat. No. 560747)을 사용하여 NSC 및 뉴런에 대한 세포 표면 표현형을 식별했습니다. panel A에서, 이종 신경 유도 배양은 유세포 분석에 의해 스크리닝되었고 잠재적인 NSC marker는 히트맵에서 확인되었습니다. CD184 + CD44-CD271-CD24 + CD15mid의 생성된 NSC 세포 표면 표현형은 세포 내 NSC 마커를 사용하여 확인되었습니다. 표면 표현형은 NSC의 near-pure subpopulation 을 분류하는 데 사용되었으며, 이후 생체 내 및 시험관 내에서 분화하는 능력이 확인되었습니다.

Diagram showing heterogeneous neural induction of cells and staining.

panel B에서, 정제한NSC는 뉴런 분리를 위한 표면 marker를 식별하기 위해 동일한 panel을 이용하여 영상화하여 스크리닝된 뉴런 및 아교 세포 집단으로 분화되었습니다. 뉴런의 고유한 형태와 뉴런 특이적 marker와 co-stain되는 능력으로 인해 imaging screening 방법이 선택되었습니다. CD44-CD184-CD24 + CD15low의 잠재적인 뉴런 표면 표현형은 유세포 분석에 의해 확인되었고 뉴런을 purify하는 데 사용되었습니다. 신경 세포 외에도 다능성 줄기세포에서 파생된 심근 세포의 세포 표면 마커를 식별하는데도 BD Lyoplate™ Human Cell Surface Marker Screening Panel 가 사용되었습니다.² 이 강력한 방법론은 알츠하이머의 인간 줄기세포 모델을 개발하는 데 사용되었습니다.³

Cell stainings showing heterogeneous neuronal differentiation and testes resulting in near-pure neurons.

참고문헌

Yuan SH, Martin J, Elia J, et al. Cell surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLoS One. 2011;6(3):e17540. doi: 10.1371/journal.pone.0017540
Uosaki H, Fukushima H, Takeuchi A, et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 2011;6(8):e23657. doi: 10.1371/journal.pone.0023657
Israel MA, Yuan SH, Bardy C, et al. Probing sporadic and familial Alzheimer’s disease using induced pluripotent stem cells. Nature. 2012;482(7384):216-220. doi: 10.1038/nature10821