Dendritic cell(DC)은 선천면역 체계와 적응면역 체계 사이의 통로 역할을 하는 다양한 조혈 세포 유형을 구성합니다. 이는 lympho-myeloid hematopoiesis (림프 골수성 조혈작용)을 통해 생성되며 bone marrow (골수)에서 분화됩니다. 병원균을 인식할 수 있어 선천적인 면역세포이지만, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질을 naïve T cell로 만들어 위협에 대응하는 과정에서 antigen을 준비하고 제시할 수도 있다. 최소 세 가지 유형의 Dendritic cell이 인정되고 있습니다. plasmacytoid DC (pDC) 및 myeloid/conventional DC (cDC)입니다 .1 이들은 종양 미세 환경에서 핵심적인 역할을 합니다.2 DC를 이용하여 암, 만성감염, 자가면역질환 치료 및 이식 내성을 유도하기 위한 면역요법 개발에 대해 관심이 높습니다. BD는 시약 포트폴리오를 계속 확장하여 multicolor 유세포 분석을 통해 DC 및 다양한 subset을enrichment, sorting 및 분석할 수 있도록 합니다.
Dendritic cell의 생물학
Dendritic cell(DC)은 선천면역 및 적응 면역에서 중요한 역할을 하는 다양한 조혈 세포 유형을 구성합니다 .3-5 자기 항원에 대한 내성을 보호하면서 외래 항원에 대한 1차적인 면역 반응을 시작할 수 있는 역량을 가진 antigen sensing 및 presenting cell (professional APC)입니다.6 DC는 immune response의 specificity, magnitude, polarity를 guide합니다.
Dendritic cell의 성숙
미성숙 DC는 골수의 progenitor cell에서 발생하며 피부, 폐 및 내장을 포함하여 전신의 거의 모든 림프 및 비림프 조직으로 이동합니다.7,8 다양한 전사 인자, 신호 분자, 성장 인자, cytokine, chemokine 및 adhesion 수용체는 일반적인 DC 전구 세포에서 성숙한 DC 로의 분화 경로와 관련되어 있습니다.3,9,10 또한 Toll-like receptors (TLR) 및 C-type을 포함한 다양한 종류의 표면 패턴 인식 수용체 (PRR)를 통해 렉틴 수용체 (CLR), 미성숙 DC는 국소적인 환경에서 손상 관련 분자 패턴 (DAMP) 또는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)을 식별하여 추가적인 성숙 신호를 수신하고 처리합니다.3,12 손상된 세포 또는 병원균을 감지하면 DC는 신체의 integrity 를 유지하기 위한 sentinel-like 기능을 수행할 수 있습니다.
성숙 조직 DC는 미세 환경 신호에 따라 표면 chemokine 수용체 및 접착 분자 profile을 변경하고 chemotactic 신호에 대한 반응으로 이차 림프 기관으로 옮겨 갑니다. 림프 조직 내에서 미성숙 resident 또는 incoming resident DC는 더 자극되고 분화되어 기능을 수행하는 성숙한DC가 될 수 있습니다. 성숙한 DC는 자기 MHC 항원과 관련하여 naive CD4 + 또는 CD8 + T cell에 대한 antigen을 처리하고 제시하는 고급 기능을 가지고 있습니다. 이것은 외래 항원에 대한 1 차 면역 반응의 시작 또는 자기 항원에 대한 잠재적 T cell 반응성의 하향 조절로 이어집니다. 성숙한 DC는 펩티드가 적재 된 MHC (major histocompatibility complex) 항원, 공동 자극 (또는 동시 억제) receptor 및 ligand (예 : CD80 및 CD86)의 증가 된 표면 발현, IL-6와 같은 cytokine의 방출을 통해 naïve T cell을 자극합니다. IL-12p70 또는 interferon (IFN) .12,13 T cell은 성숙한 DC의 특성을 추가로 조정할 수 있습니다. 반응하는 T cell은 예를 들어 CD40-CD40L 상호 작용을 통해 또는 IL-4 또는 IFN-γ와 같은 T cell –derived cytokine에 의해 DC를 상호 적으로 조절할 수 있습니다. 이러한 방식으로 T cell는 전문 professional APC에 추가로 지시할 수 있으며, 이는 다양한 유형의 T cell 의존성 면역 또는 내성을 촉진할 수 있습니다.
Dendritic cell의 여러가지 역할
DC는 면역 반응의 potent initiator일 뿐만 아니라, 후속하는 면역 반응의 유형, 크기 및 기간을 결정하는 데 중요한 조절 역할을 합니다 .1,4,10,11 DC는 cell surface ligand와 receptor의 differential expression을 통해 이를 달성합니다. 뿐만 아니라 cytokine, chemokine 및 inflammatory mediator의 뚜렷한 프로파일을 분비합니다. 예를 들어, IL-12p70을 방출하는 DC는 우선적으로 유형 1 CD4 + helper T cell (Th1) 또는 세포 용해성 CD8 + T cell를 촉진할 수 있습니다. 다른 DC 유형은 Th2, Th9, Th17, Th22, T follicular helper (Tfh) 또는 regulatory T (Treg) cell의 특징인 T cell 의존 체액성 또는 세포 매개 면역 반응을 촉진할 수 있습니다. 이러한 유형의 T cell 의존성 면역 반응을 정확히 어떤 DC가 조율하는지에 대한 문제와 그 방법은 공개되어 있으며 집중적으로 조사되고 있습니다.
일부 연구에서는 DC의 성숙도 수준이 중요하다고 지적하는 반면 다른 연구에서는 병원체 유형이나 관련된 조직 부위의 주요 영향을 지적합니다. 이들은 모두 신중한 연구가 필요한 중요한 매개 변수입니다. DC pathway 는 functional plasticity 이 매우 크기 때문에 진실은 그 사이 어딘가에 있을 것입니다 .15,16,17 DC가 타고난 면역과 적응 면역 사이에 제공하는 필수 연결 고리도 점점 더 높이 평가되고 있습니다. DC는 위험 신호에 반응하여 성숙하여 생산적인 T cell 반응을 유도할 수 있을 뿐만 아니라 대식세포, natural killer (NK) cell, natural killer T cell (NKT cell), 과립구 및 비만 세포를 활성화하여 침입 감염원에 대한 자연 반응을 유발합니다.15 Plasmacytoid DC (pDC)가 IFN의 주요 공급원이며 특정 바이러스에 반응하여 신속하게 이를 분비한다는 발견은 선천적 및 적응적 면역 반응 모두에서 DC가 수행하는 다기능적 역할을 보여주는 중요한 예입니다.
Dendritic cell heterogeneity
기원, 형태, 국소화, 성숙 상태, 표현형 및 기능이 다른 여러 유형의 precursor, 미성숙 및 성숙한 DC (예: Langerhans cell, 진피 또는 interstitial DCs, blood DCs)가 설명되었습니다. 두 종 사이의 일부 세포 표면 표현형 차이에도 불구하고, 일반적으로 허용되는 두 가지 유형의 DC가 human 및 mouse model 시스템에서 설명되었으며, 이는 서로 다른 계통을 나타내는 것으로 보이는 것으로 보입니다: plasmacytoid DC (pDC) 및 myeloid DC (mDC), 또한 classical 또는 conventional DC (cDC) .1 pDC는 IFN을 생산할 수 있는 엄청난 용량을 가지고 있지만 mDC만큼 효율적으로 antigen을 제시하지 못할 수 있습니다 .1,3 Human pDC는 CD123 및 CD304의 공동 발현으로 구별되는 반면 mouse스 pDC는 CD45R / B220 및 Ly- 6C.1,9,10 mDC의 두 가지 주요 부류가 human 및 mouse 종으로 추가로 분류되었으며, 이는 IFN 조절 인자 4 (IRF4 + DC) 또는 IRF-8 (IRF-8 + DC)의 대체 발현에 의해 정의됩니다. 11 Human의 IRF4 + DC는 특징적으로 CD1c를 발현하는 반면, mouse counterpart는 CD4 (림프 상주 DC) 또는 CD11b (이동 DC)를 발현합니다. 두 종의 IRF4 + DC는 CD172a / Sirp-α를 공동 발현하고 순진한 CD4 + T cell에 antigen을 효율적으로 제시 할 수 있습니다. 반대로, human IRF8 + DC는 일반적으로 CD141을 발현하는 반면, mouse 등가물은 XCR1 chemokine receptor, CD370 / Clec9a를 발현하고 CD4 + T cell 및 CD8 + T에 antigen을 제시 할 수 있는 모든 subset으로 CD8a (lymphoid resident DC) 또는 CD103 (migratory DC)을 발현합니다. Human 및 mouse Langerhans cell (LC)은 마찬가지로 CD207 / Langerin, CD326 / EpCAM 및 CD324 / E-Cadherin을 포함하는 몇 가지 구별되는 marker를 공동 발현합니다3,10. 두 종의 진피 및 장에 있는 DC subset도 설명되었습니다. Human 및 mouse DC counterpart에 대한 요약은 아래 표를 참조하십시오.
인간 DC 하위 집합 및 마우스 DC 대응 요소의 기능
| Human DC Subsets | Mouse DC Counterparts | Frequency | Localization | Cytokine Production Upon Stimulation* |
|---|---|---|---|---|
| pDC | pDC | ~1% peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) | Human blood Lymph node Tcell zone Tonsil |
IFN-I+, IFN-III (IFN-λ)+ IL-6+, IL-8+ IP-10 (CXCL10)+ TNF+ |
| CD1c+ DCs | CD4+ or CD11b+ DCs | ~1% PBMCs | Human blood Nonlymphoid tissues: Skin, liver, lung, and gut Lymphoid tissues: spleen, lymph nodes |
IL-1β+, IL-6+, IL-8+ IL-10+, IL-12+ IL-23+ TNF+ IL-15+ (skin) |
| CD141+ | CD8+ or CD103+ DCs | 0.03% PBMCs CD8+ DCs: 20–40% of mouse spleen and lymph node cDCs | Human lymph node, tonsil, spleen, bone marrow Human nonlymphoid tissues: skin, lung, liver, intestine CD8+ DCs: Mouse lymphoid tissues |
IFN-I+, IFN-III (IFN-λ)+ IL-12+ (mouse) CXCL-10 (IP-10)+ TNF+** |
| LCs (Langerhans cells) | LCs (Langerhans cells) | 3–5% epidermal cells | Human stratified squamous epithelia, draining lymph nodes | IL-15+ |
| Inflammatory DCs | Inflammatory DCs | Inflammatory sites | IL-1β+, IL-6+ IL-10+, IL-12+, IL-23+ TNF+ |
*Cytokine 생산은 사용된 자극제, 자극 조건 또는 세포의 생리 학적 상태에 따라 달라질 수 있습니다.
**TNF 는 일반적으로 TLR8 자극에 대한 반응으로 human CD141 + DC에 의해 생성되지 않습니다.
DC의 또 다른 부류인 inflammatory DC는 DC의 특성과 기능을 취하기 위해 환경적 자극에 의해 구동 될 수 있는 단핵구에서 발생할 수 있습니다.3 분명히 TLR, CLR, CD1 molecules, chemokine receptor 및 cytokine 분비 패턴의 표현된 프로파일을 포함한 다양한 DC subset에 대해 자극적인 종간 차이와 특정 기능 관련 분자의 유사성이 설명되고 있습니다.3 DC subset 및 성숙 단계를 포함한 요인의 조합이 결과 T cell response에 영향을 미치기 때문에 기능 연구와 결합된 상세한 표현형 분석 생리학적 조건과 병리학적 조건에서 DC 생물학의 복잡성을 더 연구하는 데 유용한 접근법 중 하나가 될 것입니다.
참고문헌
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Human dendritic cells
Human dendritic cell (DC) subset은 유세포 분석을 통해 수많은 surface 및 intracellular marker로 특성화 될 수 있습니다.
말초 혈액에 대한 다음 예는 사용 가능한 BD OptiBuild ™ 맞춤형 시약을 기반으로 DC subset 식별을 보여줍니다.
다양한 human DC subset의 표현형 특성화에 대한 주요 marker는 아래 표를 참조하십시오. intracellular marker는 굵게 표시됩니다. BD Life Sciences는 panel design 및 downstream analysis의 유연성을 허용하기 위해 이러한 특이성에 대한 광범위한 antibody 시약 포트폴리오를 다양한 형식으로 보유하고 있습니다.
모든 human DC subset 은 lineage–(CD3– CD19– CD20– CD56– CD141) 및 CD45+ MHCII (HLA-DR)+ CD11c+/-2 로 식별됩니다.
| DC Subset | Key Markers | |||
|---|---|---|---|---|
| Primary Markers | 추가 포지티브 마커 | Primary Markers | 전사 인자 | |
| Plasmacytoid DCs | CD123 (IL-3Rα)high CD303 (BDCA2/CLEC4C)+ CD304 (Neuropilin-1/BDCA4)+ CD85g (ILT7)+ CD11clow CD11b–, CD14– |
CD2±, CD4+, CD45RA+ CD141 (BDCA3)low CD272 (BTLA)+ CD366 (TIM-3)± CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD371 (CLEC12A)± TLR7high, TLR9high FLT3 (CD135)+ GM-CSFR (CD116)+ CCR5+, CXCR4+ |
CD1a–, CD1c (BDCA1)– CD16 (FcγRIII)– CD172a (Sirp-α)– CD207 (Langerin)– CD324 (E-Cadherin)– CD326 (EpCAM)– CD369 (Dectin-1/CLEC7A)– CD370 (CLEC9A/DNGR1)– CLEC6A (Dectin-2)– XCR1– |
IRF7+, IRF8+ SpiB+ |
| CD1c+ Myeloid DCs |
CD1c (BDCA1)+ CD172a (Sirp-α)+ CLEC6A (Dectin-2)+CD11b+/low, CD11c+ CX3CR1+CD14low/– |
CD4+, CD13+, CD26low, CD33+ CD45RO+, CD141 (BDCA3)± CD272(BTLA)+ CD366 (TIM-3)+ CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+ CD371 (CLEC12A)+ CD1a+ [skin and intestine] CD141(BDCA3)+ [intestine] TLR3low, TLR4low, TLR8+, TLR10low FLT3 (CD135)+, GM-CSFR (CD116)+ |
CD1a–, CD16 (FcγRIII)– CD123 (IL-3Rα)– CD207 (Langerin)– CD304 (Neuropilin-1/BDCA4)–, CD324 (E-Cadherin)– CD326 (EpCAM)– CD370 (CLEC9A/DNGR1)– ESAM– XCR1– | IRF4+ |
| CD141+ Myeloid DCs |
CD141 (BDCA3)high CD370 (CLEC9A/DNGR1)+ NECL2 (CADM1)+ CD11c+/low CD14– |
CD4+, CD11blow CD26+, CD162high CD205 (DEC-205)high CD272 (BTLA)high CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD366 (TIM-3)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+ CD371 (CLEC12A)+ TLR3+, TLR8+ FLT3 (CD135)+ GM-CSFR (CD116)+ XCR1+ |
CD1a−, CD1c (BDCA1)−, CD16 (FcγRIII)− CD172a (Sirp–α)− CD207 (Langerin)− CD304 (Neuropilin-1/BDCA4)− CD324 (E-Cadherin)− CD326 (EpCAM)− |
IRF8+ BATF3+ |
| Langerhans Cells | CD207 (Langerin)+ CD324 (E-Cadherin)+ CD326 (EpCAM)+ CD11blow, CD11c+ CD14− |
CD1ahigh, CD1c (BDCA1)+ CD36+ CD172a (Sirp-α)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+, CD371 (CLEC12A)+ CLEC6A (Dectin-2)+ TLR1+, TLR2+, TLR3low, TLR6+ |
CD304 (Neuropilin-1/BDCA4)– CD367 (DCIR/CLEC4A)– XCR1– |
|
| CD1a+ Dermal DCs |
CD1a+ CD64 (FcγRI)+ CD366 (TIM-3)+ CD11b+, CD11c+ CD14− |
CD1c (BDCA1)+ CD172a (Sirp-α)+ CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+ CLEC6A (Dectin-2)+ TLR1–3+, TLR6+, TLR7+, TLR10+ |
CD207 (Langerin)− CD209 (DC-SIGN/CLEC4L)− CD324 (E-Cadherin)− CD326 (EpCAM)− |
|
| CD14a+ Dermal DCs |
CD14+ CD209 (DC-SIGN/CLEC4L)+ CD11b+, CD11c+ |
CD1c (BDCA1)+ CD172a (Sirp-α)+ CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+ CLEC6A (Dectin-2)+ TLR1–3+, TLR6, TLR7+ CSF–1R (CD115)+ |
CD1a− CD207 (Langerin)− CD324 (E-Cadherin)− CD326 (EpCAM)− CD366 (TIM-3)− |
|
| Inflammatory DCs (Monocyte-Derived DCs) |
CD16 (FcγRIII)+ CD64 (FcγRI)+ CD1a+ CD1c (BDCA1)+ CD11b+, CD11c+ CD14± |
CD172a (Sirp-α)+ CD206 (MR/CLECL13D)+ CD209 (DC-SIGN/CLEC4L)+ CD367 (DCIR/CLEC4A)+ CD369 (Dectin-1/CLEC7A)+ CD371 (CLEC12A)+ CLEC6A (Dectin-2)+ TLR3low, TLR4+, TLR7low, TLR8+ CCR2 (CD192)+ |
CD207 (Langerin)− CD324 (E-Cadherin)− CD326 (EpCAM)− |
1CD14 는 CD14 + 진피 DC 및 염증성 DC를 제외한 모든 DC 하위 집합에서 음성이거나 낮습니다.
2CD11c 는 발현이 낮거나 음성으로 보고된 plasmacytoid DC를 제외한 모든 DC subset에서 양성입니다.
TLR7, 8 및 9 는 endosomal이며 intracellular staining이 필요합니다.
Mouse dendritic cells
Mouse dendritic cell (DC) subset는 유세포 분석을 통해 수많은 surface 및 intracellular marker 로 특성화 될 수 있습니다.
Mouse spleen에 대한 다음 예는 사용 가능한 BD OptiBuild ™ 맞춤형 시약을 기반으로 DC subset 식별을 보여줍니다.
Mouse dendritic cell subset의 immunophenotyping. Mouse spleen에서 mouse DC의 세 가지 주요 subset (골수성, 림프성 및 형질 세포성)의 10 색 면역 표현형 특성 분석. BALB / c Mouse spleen을 효소로 분해하고 antibody 칵테일 (BD OptiBuild ™ 시약 Sirpα BV650 및 Clec12A BV786 포함)으로 staining하고 BD FACSCelesta ™ Flow Cytometer Blue / Violet / Red (BVR) laser 구성에서 분석했습니다.
Cell은 처음에 CD3, CD19 및 7-AAD negative cell (표시하지 않음)에서 gating 되었습니다. (A-D). gating 전략 : I-A / I-EhighCD11chigh 기존 dendritic cell (DC)는 CD11b + mDC 및 CD8 + lDC로 더 구별되었습니다. I-A / I-ElowCD11clow B220 + Gr1 + cell은 pDC로 인식되었습니다. 결과 : 추가 marker CD4, CD172a (Sirpα) 및 CD371 (Clec12A)의 차별적 발현은 mDC (E, F, G), lDC (H, I, J) 및 pDC (K, L, M) 내에서 추가로 분석되었습니다. 각각 subset gate는 fluorescence minus one (FMO) control을 기반으로 그려졌습니다.
다양한 mouse DC subset의 표현형 특성화에 대한 주요 marker는 아래 표를 참조하십시오. intracellular marker는 굵게 표시됩니다. BD Life Sciences는 panel design 및 downstream analysis 의 유연성을 허용하기 위해 이러한 특이성에 대한 광범위한 antibody 시약 포트폴리오를 다양한 형식으로 보유하고 있습니다.
Mouse DC marker는 lineage–(CD3– CD19– CD49b– 또는 NK1.1– CD14–) 및 CD45 + MHCII + CD11c +로 식별됩니다.
| DC Subset | Key Markers | |||
|---|---|---|---|---|
| Primary Markers | Additional Positive Markers | Additional Negative Markers | Transcription Factors | |
| Plasmacytoid DCs (pDCs) |
CD45R (B220)+ CD317 (BST-2)+ Ly-6C+ Siglec-H+ CD11clow CD14− |
CD4+, CD26+ CD172a (Sirp-α)+ CD209a (DC-SIGN)+ CD272 (BTLA)+ CD370 (Clec9a/DNGR1)+ Gr1 (Ly-6C and Ly-6G)+ FLT3 (CD135)+ TLR7high, TLR9high |
CD11b− CD24− CD36−, CD64 (FcγRI)−, CD103− CD205 (DEC-205)− CD207 (Langerin)− CD326 (EpCAM)− DCIR2 (Clec4a4/33D1)− F4/80− CX3CR1−, XCR1− |
IRF7+, IRF8+ BATF3high SpiB+ Zbtb46− |
| CD4+ CD11b+ Lymphoid-Resident DCs |
CD4+ CD11b+ CD11chigh CD8a− CD14− |
CD24+, CD26+ CD172a (Sirp-α)+ CD205 (DEC-205)+ CD209a (DC-SIGN)+ CD272 (BTLA)low DCIR2 (Clec4a4/33D1)+ ESAM+ F4/80+ FLT3 (CD135)+ TLR5+, TLR7+, TLR9+ CX3CR1+ |
CD36− CD45R (B220)− CD64 (FcγRI)−, CD103− CD207 (Langerin)− CD326 (EpCAM)− CD370 (Clec9a/DNGR1)− Ly6C− XCR1− |
IRF4+ Zbtb46+ BATF3high |
| CD4− CD11b+ Conventional Migratory DCs |
CD11b+ CD11c+ CD4− CD8a− CD14− |
CD24±, CD26+ CD64 (FcγRI)+ CD172a (Sirp-α)+ CD209a (DC-SIGN)± CD272 (BTLA)low DCIR2 (Clec4a4/33D1)+ F4/80+ Ly-6C± FLT3 (CD135)+ TLR5+, TLR7+, TLR9+ CX3CR1+ |
CD36− CD45R (B220)−, CD103− CD207 (Langerin)− CD326 (EpCAM)− CD370 (Clec9a/DNGR1)− XCR1− |
IRF4+ IRF2+ Zbtb46+ BATF3high |
| CD8a+ Conventional Lymphoid-Resident DCs |
CD8a+ CD11chigh CD4− CD11b− CD14− |
CD1d1+, CD24+, CD26+ CD36+, CD103± CD205 (DEC-205)+ CD207 (Langerin)± CD272 (BTLA)high CD370 (Clec9a/DNGR1)+ NECL2 (CADM1)+ FLT3 (CD135)+ TLR3+, TLR4+, TLR11+ XCR1+, CX3CR1± |
CD45R (B220)− CD64 (FcγRI)− CD172a (Sirp-α)− CD209a (DC-SIGN)− CD326 (EpCAM)− DCIR2 (Clec4a4/33D1)− F4/80− Ly-6C− |
IRF8+ BATF3+ Zbtb46+ |
| CD103+ Conventional Migratory DCs |
CD103+ CD11chigh CD4− CD8− CD11b− CD14− |
CD1d1+, CD24+ CD26+, CD36+ CD205 (DEC-205)+ CD207 (Langerin)+ CD272 (BTLA)high CD370 (Clec9a/DNGR1)+ NECL2 (CADM1/CD317)+ FLT3 (CD135)+ TLR3+, TLR4+, TLR11+ XCR1+ |
CD45R (B220)− CD64 (FcγRI)− CD172a (Sirp-α)− CD209a (DC-SIGN)− CD326 (EpCAM)− DCIR2 (Clec4a4/33D1)− F4/80− Ly-6C− CX3CR1− |
IRF8+ BATF3+ Zbtb46+ |
| Langerhans Cells | CD207 (Langerin)+ CD324 (E-Cadherin)+ CD326 (EpCAM)+ CD11b+ CD11c+ CD14− |
CD24+ CD172a (Sirp-α)+ CD205 (DEC-205)+ F4/80+ TLR3+, TLR11+ |
CD8a−, CD26−, CD36− CD45R (B220)−, CD103− CD209a (DC-SIGN)− CD370 (Clec9a/DNGR1)− DCIR2 (Clec4a4, 33D1)− Ly-6C− CX3CR1−, XCR1− |
|
| CD207+ Dermal DCs | CD207 (Langerin)+ CD11blow CD11c+ |
CD103± | CD45R (B220)− CD172a (Sirp-α)− CD326 (EpCAM)− |
|
| CD207− Dermal DCs | CD207 (Langerin)− CD11b± CD11c+ |
CD172a (Sirp-α)+ | CD45R (B220)− CD103− CD326 (EpCAM)− |
|
| Inflammatory DCs (Monocyte–Derived DCs) |
CD64 (FcγRI)+
CD11b+ CD11c+ CD14− |
CD209a (DC-SIGN)+ CD272 (BTLA)low Ly-6C+ TLR1-6, TLR7-8+, TLR10+ |
CD8a−, CD45R (B220)−, CD103− CD172a (Sirp-α)− CD207 (Langerin)− CD326 (EpCAM)− |
Dendritic cell 분리
특정 연구 접근법은 추가 특성화, 배양 또는 기능 연구를 위해 Dendritic cell (DC)의 분리된 population을 사용해야합니다. 혈액 단핵 세포의 0.1-1 % 만 차지하는 이러한 매우 희귀 한 세포 유형의 분리는 역사적으로 한계였습니다.3 유세포 분석 및 자기 비드 분리 기술의 발전으로 DC 분리가 더 쉬워졌습니다. 유세포 분석 기반 세포 분류를 통해 추가 분석을 위해 single cell을 분리할 수 있습니다.
Dendritic cell populations
분리된 DC population은 종종 T cell과의 공동 배양 또는 기타 downstream application과 같은 기능 분석을 수행하는 데 사용됩니다. BD Biosciences는 human 및 mouse DC의 성공적인 분리를 위한 접근 방식을 제공합니다.
BD IMag ™ Cell Separation System 은 단순하지만 매우 효과적인 direct magnet technology 를 기반으로 합니다. 예를 들어, 연구자들이 BD IMag ™ 입자 형식의 세포 표면 결합 항체를 선택하면 DC의 양성 또는 음성 선택이 가능합니다. 사용하기 쉬운 human 및 mouse DC enrichments set는 몇 가지 짧은 단계로 비 DC 집단의 음성 선택을 채택할 수도 있습니다.
Flow cytometric sorting은 고순도 및 세포 회수율을 제공하고 다중 마커 표현형에 의해 정의된 cell을 분리하는 매우 효과적인 방법입니다. 많은 연구자들이 특정 DC population을 분리하기 위해 BD FACSAria ™ Cell Sorter 를 사용했습니다 .5
human PBMC에서 pDC 및 mDC 분리
Plasmacytoid DC (pDC) 및 myeloid DC (mDC)는 표현형 Lin– HLA-DR + CD123 + CD11c– (pDC) 및 Lin– HLA–DR + CD123– CD11c + (mDCs)를 기반으로 human peripheral blood에서 분리할 수 있습니다. 아래 표시된 예에서, BD IMag ™ Human Dendritic Cell Enrichment Set, Cat. No. 558420, human peripheral blood (PBMC)에서 적혈구, 혈소판 및 말초 백혈구 (DC가 아님)를 음성으로 선택하여 세포 표면 염색 및 분류를 위한 DC-enriched sample 를 제공합니다.
Cell을 lineage cocktail FITC, CD123 BV421, HLA-DR PE 및 CD11c APC로 staining했습니다. viability dye FVS780을 사용하여 dead cell을 배제했습니다. BD FACSAria ™ Flow Cytometer를 사용하여 cell를 sorting했습니다. BD IMag ™ Particle-based enrichment 및 flow cytometric sorting 의 조합은 일반적으로 인간 혈액의 낮은 빈도에서 발견되는 고순도 DC population을 생성하는 편리한 workflow입니다.
BD Application Specialist는 연구자의 sorting application에서 귀하를 지원하기 위해 현장 또는 전화 기반 조언을 제공할 수 있습니다. 자세한 내용은 지원 페이지를 방문하십시오.
BD FACSMelody ™, BD FACSAria ™ III, BD FACSAria ™ Cell Sorter와 같은 BD 유세포 분석 플랫폼은 single-cell을 다양한 유형의 plate로 분류하는 것을 지원합니다. Single-cell sorting는 deposition unit에 의해 가능하며, 이 utility는 각 정렬된 event에 대해 flow cytometric data (예: marker phenotype) 및 sort location (sort-collection device의 X 및 Y 좌표)를 기록하는 index-sorting function 과 결합될 때 향상됩니다. 이러한 방식으로 DNA 또는 RNA 서열 분석을 포함할 수 있는 분류 후 분석 결과를 specific cell의 flow characteristic으로 정확하게 추적할 수 있습니다.
Cytokine detection
Dendritic cell (DC)에서 분비되는 cytokine의 유형과 양을 측정하면 DC 반응의 특성과 크기에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 멀티 플렉스 분석은 cytokine 및 chemokine과 같은 분비 인자를 측정하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다.
형광 검출 및 다중 측정의 넓은 동적 범위를 통해 적은 샘플 부피, 적은 샘플 희석 및 기존의 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 접근법에 비해 미지의 값을 설정하는 데 걸리는 시간을 크게 줄일 수 있습니다.
BD® CBA 포트폴리오에는 cytokine 또는 chemokine 같은 분비 단백질, 방출 된 세포 표면 마커 (예 : sCD14)와 세포 용해물 내 인단백질과 같은 세포 신호 분자를 포함한 다양한 가용성 인자 측정을 위한 분석이 포함됩니다.
Intracellular detection of cytokines
Protein transport inhibitor를 사용하여 분비를 차단함으로써 cytokine 이 생산되는 cell에서 검출될 수 있습니다. 따라서, 활성화된 cell population에 의한 cytokine 생산이 다량의 cytokine 을 생산하는 소수의 cell 또는 각각 소량의 cytokine 을 생산하는 다량의 cell population의 결과인지 구별하는 것이 가능합니다.
Transcription factor 및 기타 intracellular proteins
성숙한 DC의 초기 발달에서 effector 기능에 이르기까지 DC 생리학의 분석은 발달 상태, 세포 활성화 또는 기타 기능적 특성과 관련된 cell 내 변화를 밝혀 냈습니다.
BD는 이러한 intracellular molecule를 분석할 수 있는 솔루션을 제공하여 연구자들이 DC 생물학을 조절하는 상호 연결된 경로를 해독하도록 지원합니다.
Detection of transcription factors
BD는 여러 DC 관련 유세포 분석 검증된 transcription-factor antibody를 제공합니다. 예를 들어, mouse에서 Zbtb46은 기존 DC 및 그 전구체에서 발현되지만 pDC에서는 발현되지 않습니다. 반대로 Spi-B는 pDC 개발 및 기능에 필요합니다 .2
Detection of phosphoproteins
BD Phosflow ™ antibody는 유세포 분석을 위해 검증된 monoclonal phosphoepitope-specific antibody입니다. 대부분의 BD Phosflow ™ Antibodies에 권장되는 투과 완충액은 BD Phosflow ™ Perm Buffer III이지만, 예를 들어 subpopulation 분석을위한 cell surface staining 을 가능하게 하는 대체 투과 완충액도 사용할 수 있습니다.
다수의 BD Phosflow ™ Antibody specificitiy은 pDC 개발에 다른 영향을 미치는 pSTAT3 및 pSTAT5 용 시약과 같이 DC 개발 및 활성화와 관련된 신호 전달 경로 분석에 사용할 수 있습니다. BD Phosflow ™ 시스템은 시험관 내에서 pDC의 바이러스 감염 후 pSyk와 같은 인 단백질을 측정하는 데 사용되어 왔으며 선천성 및 적응성 면역을 위한 세포 신호 연구에 널리 사용됩니다.
면역 형광 및 면역 조직 화학
DC morphology and subcellular localization
형광 이미징과 함께 monoclonal antibody를 사용하면 조직 내에서 DC를 식별하고 체외에서 DC 생물학의 기계적 측면에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) 및 BD Horizon ™ BV480과 같은 새롭고 밝은 photostable fluorescent dye에 직접 접합된 BD monoclonal antibody를 사용하면 기존의 3-4 color microscopy를 넘어서는 multicolor imaging 이 가능합니다.
참고문헌
- Merad M, Sathe P, Helft J, Miller J, Mortha A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu Rev Immunol. 2013;31:563-604. doi: 10.1146/annurev-immunol-020711-074950
- Collin M, McGovern N, Haniffa M. Human dendritic cell subsets. Immunology. 2013;140(1):22-30. doi: 10.1111/imm.12117
- Schraml BU, Reis e Sousa C. Defining dendritic cells. Curr Opin Immunol. 2015;32:13-20. doi: 10.1016/j.coi.2014.11.001
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