BD FACSChorus™ Software

HEK-293 세포를 0.25 μg의 pAcGFP (Clontech) 벡터로 transfection시키고 GFP의 발현에 대해 분석했습니다. 다양한 수준의 GFP를 발현하는 세포는 명확하게 구분 될 수 있습니다. DAPI는 죽은 세포를 배제하기 위해 사용되었습니다. Purity 모드에서 초당 1,000 개 event에서 낮은 수준과 높은 수준의 GFP를 발현하는 세포를 식별하고 분류하기 위해 gate를 그렸습니다. 정렬 후 분석결과 두 집단 모두에서 순도가 99 %를 초과하는 것으로 나타났습니다.

HEK-293 세포를 70 % 에탄올로 고정하고 0.5μg / mL의 DAPI로 염색했습니다.

(A) 집단 계층. SSC, FSC 및 DAPI에 대한 A, H 및 W parameter를 순차적으로 사용하여 doublet 및 세포 응집체를 제외했습니다. 이 실험에 사용된 gating 전략은 유사 분열 수치를 과소 평가하거나 배제했을 가능성이 있습니다.

(B) DNA content 분석. DAPI singlet gate 내의 세포는 2N과 4N 사이의 DNA content를 보여주어> 4N doublet 또는 응집체의 배제를 확인했습니다.

(C) Single-cell 증착 정렬 후 검증. DAPI singlet gate의 세포는 99.7 %의 single-cells증착 효율로 3 개의 96 -multiwell plates로 분류되었습니다. 현미경을 사용하여 well당 하나의 세포가 존재함을 확인했습니다. 하나의 세포를 포함하는well의 대표 이미지를 표시했습니다.

건강한 기증자로부터 얻은 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고 Treg  subset 의 측정 및 정제를 위해 표면 marker cocktail(CD3, CD4, CD25, CD127 및 CD45RA)로 염색했습니다. 림프구 및 singlet은 우선 FSC,SSC 특성을 기반으로 gating 된 다음 CD3 + CD4 + T cell로  gating(표시되지 않음) 했습니다. Tregs 는CD127low/neg CD25high로 식별되었습니다. Treg gate에서 CD45RA + naïve 및 CD45RA– memory Tregs를 식별하고 purity 모드에서 초당 5,000 개 이벤트로 분류했습니다. 정렬 후 분석 결과  memory와 naïve Treg의 동종 집단이 밝혀졌습니다. 이어서 정제된 세포를 면역 표현형을 위한 추가 표면 marker(CD31, CD39 및 CD15)에 대해 염색했습니다. CD31 + recent thymic emigrants (RTEs)은 CD45RA + naive Tregs 내에서 측정된 반면, 고도로 활성화된 Tregs는 CD45RA- memory Tregs 내에서 측정되었습니다.

BALB/c 마우스 비장 세포는 collagenase를 사용한 기계적 mincing 및 효소적 소화 후에 분리되었습니다.

(A) BD IMag™ Mouse Dendritic Cell Enrichment Set 를 bulk 선택에 사용하여 MHC II + CD11chigh 기존 수지상 세포의 CD8α + 및 CD8α- subset를 각각 35 배 및 29 배 농축했습니다.

(B) Bulk 선택 후, CD8α + 및 CD8α- subset는 purity 모드에서 초당 1,000 개 event로 분류되었습니다. 정렬 후 분석 결과 두 subset에서 모두 순도가 99 %를 초과하는 것으로 나타났습니다.