Image showing sets of test tubes used for experiments.

Proliferation
(세포증식)

Cytokine 치료와 같은 multiple자극은 세포 증식에 영향을 미칠 수 있습니다. 세포 증식은 cytokine 노출과 같은 자극 또는 다양한 프로세스에 대한 반응으로 발생할 수 있습니다

Cell proliferation dyes

BD Biosciences는 violet laser와 blue laser를 각각 사용하여 세포증식을 측정하기 위한 BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450) and BD Horizon™ CFSE 를 제공하며, 이는 더 많은 panel의 사용을 촉진시킵니다. Multicolor 유세포 분석을 이용하여 제한된 샘플에서 더 많은 데이터를 결정할 수 있습니다.

이 proliferation dye는 모두 nonfluorescent esterified dye입니다. ester group 은 dye 가 세포안으로 침투할 수 있도록 합니다. Dye 가 세포 내부로 침투하면 esterase가 ester group을 절단해서 dye를 fluorescent product 로 변환시키고 세포 내부에 가두어 둡니다. 각 replication event에서 세포 내 dye가 감소하여 특징적인 패턴이 나타납니다.

Diagram showing how cell proliferation dye enters and affects cells.

BD Horizon™ Cell Proliferation Dye가 세포 내부에 자유롭게 들어갑니다. Dye는 일단 세포 내부에 들어가면 nonspecific esterases에 의해 절단되고 형광분자를 방출하여 세포 내부에 갇히게 됩니다.

Data showing BRDU APC and 7-ADD on no-load cells.

Data showing BRDU APC and 7-ADD with DMSO control group.

Data showing BRDU APC and 7-ADD with 1 micrometer VPD450.

Data showing BRDU APC and 7-ADD with VPD450 on no-load cells.

Data showing BRDU APC and 7-ADD with VPD450 on DMSO control group.

AntiCD3e 및 anti-CD28로 자극된 mouse의 spleen(비장)에 대한 VPD450 및 세포주기 동역학의 농도. C57 Black/6 splenocytes을 다양한 농도의 BD Horizon ™ VPD450, DMSO로 load하거나 untreated control로 방치한 다음 2 일 동안 anti-CD3e 및 anti-CD28로 자극했습니다. Cell harvesting 전 BrdU로 pulsing한 다음 APC anti-BrdU 및 7-AAD (Cat. No. 552598)로 염색했습니다. 상단 panel (A–C)은 APC 항BrdU 및 7-AAD 염색을 나타낸 것입니다. 하단 panel (D–F)은 해당 VPD450 histogram을 보여줍니다. Controls cell (Cells–) (Panel A)과 1μM VPD450 loaded cell population (Panel C)에서는 BrdU + cell이 유사한 비율(각각 40.7 % 및 39.8 %)로 나타났습니다. Dye의 농도가 더 높은 경우 cell proliferation에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). DMSO (VPD450의 용매로 사용됨)가 proliferation 감소의 원인이 아님을 확인하기 위해 DMSO group을 포함했습니다(Panel B). Cell group 및 1μM VPD450 – loaded cell population 과 비교하여 DMSO 처리된 cell은 유사한 BrdU 백분율을 보였습니다.

BrdU로 cell proliferation 측정

BD Biosciences는 de novo DNA 합성을 측정하는데 사용되는 DNA precursor인 thymidine의 유사체인 bromodeoxyuridine (BrdU)을 측정하여 증식 세포를 측정하도록 설계된 일련의 항체 및 키트를 제공합니다.

Cell cycle S기 (DNA 합성) 동안 BrdU는 새로 합성된 DNA에 통합되며 anti -BrdU 특정 항체에 의해 쉽게 측정될 수 있습니다. BrdU 검출 용으로 설계된 BD 항체 및 키트는 cell 내 유세포 분석 및 immunohistochemistry에 모두 사용할 수 있으며 BD Horizon ™ V450, BD Horizon Brilliant Violet ™ 510 (BV510), PerCP-Cy5.5 및 기타 format을 포함합니다.

DNA의 증가와 더불어, 특정 단백질의 수준도 cell proliferation의 결과로 증가합니다. 예를 들어, Ki67은 dividing cell의 핵에서 발현되는 항원입니다. 그러나 cell cycle G0 기에서는 감지되지 않습니다. Ki67은 BrdU 및 VPD450과 같은 다른 증식 marker와 결합하여 신뢰도를 높일 수 있습니다. 이러한 마커는 cell 표면 및 기타 유형의 마커와 결합하여 세포 subset및 신호 경로에 대한 추가 정보를 얻을 수 있도록 합니다.

마우스 비장 세포의 세포 증식 분석

Data showing IL-2AlexaFluor®488 and VPD450 on day 1.

Data showing IL-2AlexaFluor®488 and VPD450 on day 2.

Data showing IL-2AlexaFluor®488 and VPD450 on day 3.

CD4 + enriched mouse splenocyte에 1μM VPD450을 10 분 동안 load했습니다. 그 다음 cell을 anti -CD3 / CD28로 자극하고 지정된 시간에 harvest했습니다. harvest하기 약 4 ~ 6 시간 전에 BD GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor 가 있는 상태에서 PMA / ionomycin으로 cell을 자극했습니다. 세cell을 고정 및 투과화하고, IL-2에 대해 염색하고 BD^® LSR II 유세포 분석기에서 분석했습니다.

리소스

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