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Series of test tubes with a pippette dripping liquid into one.

Overview
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Fluorescence imaging 기반 기술은 세포 및 조직 측면의 구조 및 기능을 조사하는 데 매우 유용하게 사용됩니다. Immunochemistry와 결합하면 분석 역량이 상당히 증가하여 다양한 연구 및 임상 응용분야에서 귀중한 도구로 사용됩니다. Immunofluorescence microscopy는 전체 세포 기관을 관찰할 수 있는 live-cell imaging을 가능하게 하여 생물학 분야에 혁명을 일으켰습니다. Immunohistochemistry 및 immunocytochemistry 은 세포 분석을 위한 항원-항체 결합의 힘을 이용하는 일반적인 fluorescence-imaging 기법입니다.

 

 

Immunofluorescence 이란 무엇이며 어디에 적용되나요?

Immunofluorescence (IF)은 현미경을 사용하여 표적 단백질 및 기타 관심 분자에 결합된 형광 dye 결합 항체를 관찰하는 강력한  immunostaining 기법입니다. IF는 세포에서 세포 및 조직 특이적 항원을 식별하는데 사용됩니다. 단백질의 존재여부, 세포 localization및 활성화 상태를 관찰하며 면역 반응을 분석합니다. 

 

Immunofluorescence 원리와 유형

IF는 형광 분자 또는 fluorophore 의 특성을 이용하여 특정 파장(분자의 흡수 스펙트럼)에서 광자를 흡수하고 에너지 손실을 동반한 짧은 interval(방출 스펙트럼) 이후에 더 높은 파장에서 광자를 방출합니다. 방출된 fluorescence 은 현미경으로 관찰할 수 있습니다.  Fluorophore 은 가시광선이나 자외선에 의해 excited될 수 있습니다.

높은 광안정성과 형광 양자수율을 가진 형광 dye는 400 ~> 700 nm의 파장 범위에 걸친 excitation 최대값으로 상업적으로 이용 가능합니다.  Living cell을 손상시키지 않으며 생물학적 제제에 안전하게 사용할 수 있습니다.

 

Immunofluorescence 세포 또는 조직은 먼저 고정 및 투과됩니다. Immunostaining 위해 fluorophore 은 관심 대상 항원에 대한 항체에 접합되고,  fluorescence signal 은 imaging microscopy를 이용하여 측정합니다. IF는 사용된 항체와 필요한 신호 증폭에 따라 직접적인 방법 및 간접적인 방법으로 분류할 수 있습니다.

 

직접 immunofluorescence(IF)

Single antibody (1 차 항체)는 관심대상 단백질을 면역 염색하고 측정하는데 사용됩니다. Fluorophore 결합 1 차 항체는 관심 항원에 직접 결합하고 imaging microscopy 를 이용하여 측정합니다.

 
Relative absorption and emission spectra.
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직접 IF의 장점

  • 두 항체에 대해 서로 다른 종 반응성을 선택해야 할 필요성이 제거됨에 따라 종 교차 반응성 문제 감소시킵니다.
  • 간접 IF에 비해 시간이 단축됩니다.(단계 간소화)

 

직접 IF의 단점

  • 2 차 항체를 통한 신호 증폭을 허용하지 않습니다.
  • 검출 민감도가 감소합니다.
  • fluorophore-접합 1차 항체의 선택이 제한적입니다.
  • 형광 이차 항체를 사용한 측정에 비해 비용이 많이 듭니다.

 

간접 immunofluorescence(IF)

2 개의 항체 (1 차 및 2 차 항체)는 관심있는 단백질을 면역 염색하고 검출하는 데 사용됩니다. 첫째, 관심 단백질은 특정 1 차 항체로 표지됩니다. Fluorophore 결합 2 차 항체 (1 차 항체와 다른 종 반응성)는 결합된 항원-항체 복합체를 인식하고 1 차 항체에 결합합니다. 하나 이상의 이차 항체가 일차 항체에 결합할 수 있기 때문에 형광 신호가 증폭되어 측정 민감도가 높아집니다. 

 
Diagram showing direct immunofluorescence.
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간접IF의 장점

  • 1 차 항체에 결합할 수있는 2 차 항체의 수를 통해 신호를 증폭시킵니다.
  • 직접 IF에 비해 신호 증폭을 통한 측정 민감도가 향상됩니다.
  • Fluorescent- 표지된 2차 항체 선택이 광범위합니다.
  • Fluorophore 접합 1 차 항체를 사용한 측정에 비해 비용이 저렴합니다.

 

간접IF의 단점

  • 두 가지 다른 종 반응성을 가진 두 개의 항체가 필요하기 때문에 종 교차반응이 증가한다는 문제가 있습니다.
  • 직접 IF에 비해 시간이 오래 걸립니다. (더 많은 단계)
 
Diagram showing direct immunofluorescence.
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IF Microscopy, ICC and IHC
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Immunofluorescence microscopy란 무엇이며 어디에 적용되나요?

직접 및 간접 IF 모두 형광 신호의 관찰을 위해 이미징 현미경을 사용합니다. 실험적 필요와 요구 사항에 따라 에피형광 또는 confocal 현미경이 이미징에 사용됩니다.

 

Epifluorescence 또는 wide-field microscopy

세포 형태, 세포 단백질의 존재 및 localization,  marker 및 세포 표현형 분석을 관찰할 수 있습니다.

 

Confocal 현미경

고해상도 샘플의 3D 이미지가 필요할 때 사용됩니다. 단백질의 세포내 localization, 공동 국소화 및 단백질-단백질 상호 작용을 분석하는데 사용됩니다.

 

Typical fluorescence microscopy channels

Various wavelength results for immunofluorescence.

Immunocytochemistry, immunohistochemistry 및 immunofluorescence?

Immunocytochemistry (ICC) 및 immunohistochemistry (IHC) 모두 분석을 위해 항원의 면역 표지를 사용하고 immunofluorescence  방법을 사용합니다.  Immunocytochemistry and immunofluorescence 같은 의미로 사용되는 경우도 있습니다.

 

ICC는 세포 수준의 분석에 초점을 두지만  IHC는 전체 조직을 검사할 수 있습니다. 두 기술 모두 측정을 위해 immunofluorescence를 사용합니다. 효소 기반 검출 (예 : 3,3'-diaminobenzidine (DAB) 사용)을 사용하는 것도 가능합니다.

 

 
Wavelength results for BV421, BV480, 488 Fluor, 568 fluor, 647 fluor dyes.
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Robust and easy 5-color imaging


효소 측정에 비해 immunofluorescence  기반 검출의 장점
  • 형광 신호를 정량화하는 기능 (효소 기반 방법을 사용한 정성적 측정과 반대)
  • Multiplex 기능 (발광 스펙트럼이 다른 형광 dye를 결합하여 여러 단백질을 측정할 수 있음)
  • 형광dye의 광안정성

 

Photostability of BV dyes

Excitation light에 지속적으로 노출. 세포 : MCF7 세포. 고정 : BD Cytofix ™ 고정 buffer (Cat. No. 554655). 항체 : Purified Mouse Anti-Human CD324 (Cat No. 562869) with BD Horizon Brilliant Violet ™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No. 564877), BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) Goat-Anti-Mouse (Cat. No. 563846) 또는 Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse (Thermo Fisher Scientific). 기타 시약 : ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). 장비: ImageXpress® Micro XLS System (Molecular Devices). 20X objective 배율

 
Chart showing fluorescence intensity over time for BV421, BV480, Alexa Fluor® 488.
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Recommended Filter Configurations
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BD Biosciences immunofluorescence imaging 제품 프로토콜

BD Biosciences는 monoclonal antibodies, 형광 dye, 2 단계 시약 및 buffer의 포괄적인 포트폴리오를 포함하는 fluorescence imaging 을 위한 고품질 도구를 제공합니다. immunofluorescence 및 조직 절편의 준비 및 염색을 위한 프로토콜을 제공합니다. 

Immunofluorescence imaging 프로토콜 및 리소스

 샘플 및 immunofluorescence 분석을 지원하기 위해 프로토콜을 제공합니다.

 

BD Biosciences의 이미징을 위한 형광 dye는 형광 이미징 분야의 경험을 바탕으로 Sirigen Ltd.에서 인수한 폴리머 dye 기술을 사용합니다. 형광 dye의 탁월한 밝기로 민감도가 향상됩니다. 고유한 스펙트럼으로 multiplexing이 수월해집니다.

 

BD Horizon Brilliant™ Fluorophores

 

Learn more about BD Horizon Brilliant Violet™ Imaging Reagents

BD Horizon Brilliant™ Fluorophores를 채택하여 광학구성 결정
사용하는 현미경 유형 및 요구사항에 따라 권장되는 필터 구성을 확인할 수 있습니다.
  • Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets
    Blue DAPI 377/50 409 430/24 or 440/40 Chroma or Semrock
    Aqua BD Horizon Brilliant
    Violet™ 480 (BV480)
    445/20 or 438/24 458 483/32 Chroma or Semrock
    Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock
    Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Far Red Alexa Fluor® 647 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor

    향상된 immunofluorescence assays를 위해 BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)를 채택하는 경우 권장되는 필터 구성입니다.

  • 한 개의 밝은 dye구성입니다. 향상된 면역형광 assays를 위한 BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421)

     

    Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets
    Blue BD Horizon Brilliant
    Violet™ 421 (BV421)
    392/23 or 377/50 409 430/24 or 447/60 Chroma or Semrock
    Aqua BD Horizon Brilliant
    Violet™ 480 (BV480)
    438/24 or 445/20 458 483/32 Chroma or Semrock
    Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock
    Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Far Red Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor

    향상된 immunofluorescence assays를 위해 BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) 채택을 하는 경우 권장되는 필터 구성입니다.

     

     

    두 가지 밝은 염료를 위한 구성입니다. 향상된 면역형광 assays를 위한 BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) 및 BV480

     

     

    Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets
    Blue BD Horizon Brilliant
    Violet™ 421 (BV421)
    392/23 or 377/50 409 430/24 or 440/40 Chroma or Semrock
    Aqua BD Horizon Brilliant
    Violet™ 480 (BV480)
    438/24 or 445/20 458 483/32 Chroma or Semrock
    Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock
    Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
    Far Red Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor
  • Up to 5-Color Configuration Laser Line Dyes
    DAPI Essential 405 nm DAPI
    440 nm or 458 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)
    488 nm Alexa Fluor® 488 or GFP
    561 nm Alexa Fluor® 568 or RFP
    633 nm Alexa Fluor® 647
    Alternate DNA Stain 405 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) and
    BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)
    440 nm or 458 nm Laser line not essential
    488 nm Alexa Fluor® 488 or GFP
    561 nm Alexa Fluor® 568 or RFP
    633 nm DRAQ5™ or Alexa Fluor® 647
Sample Data
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항체 및 시약을 사용하여 생성된 샘플 데이터

Multicolor fluorescence immunohistochemistry staining of mouse spleen tissue

CX3CR1- green 형광 단백질(pseudo-colored green) 및 CCR2- red 형광 단백질 (pseudo-colored red)을 발현하는 마우스의 비장 냉동 절편 (5μm)을 BD Cytofix ™ 고정 buffer (Cat. No. 554655)로 고정하고 5 % 염소 혈청 및 1 % BSA를 1X PBS에 희석하고 BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) Rat Anti-Mouse CD4 (Cat. No. 562891) (pseudo-colored magenta), Alexa Fluor® 647 Rat Anti-Mouse CD45R/B220 (Cat No. 557683) (pseudo-colored yellow) 및 BD Horizon Brilliant Violet ™ 480 (BV480) Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex (pseudo-colored cyan)로 염색했습니다. 슬라이드를 ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific)로 장착하고 이미지를 BD Pathway 435 세포 분석기 (epifluorescence microscope)에서 캡처하고 BD Attovision Software를 사용하여 병합했습니다. 20X objective 배율. La Jolla 알레르기 및 면역학 연구소의 Catherine Hedrick 실험실과 공동으로 수행한 연구입니다.

 
Grid of 6 fluorescence results from mouse spleen sample.
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Multicolor immunocytochemistry using BD Horizon™ BV480

MCF-7 세포 (ATCC, HTB-22)를 BD Cytofix ™ 고정 buffer (Cat. No. 554655)로 고정하고 0.1 % Triton ™ X-100으로 투과시키고 5 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.5 %로 차단했습니다. 1X PBS의 Triton ™ X-100. 세포를 Purified Mouse Anti-E-Cadherin (Cat. No. 610182)과 함께 배양하고, 2 단계 시약은 BD Horizon Brilliant Violet ™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No. 564877) (pseudo-colored aqua). 이어서 세포를 직접 접합된 항체로 염색했습니다 : Alexa Fluor® 488 Mouse Anti-β-Tubulin (Cat No. 558605) (pseudo-colored green), Alexa Fluor® 555 Mouse Anti-Human Ki-67 (Cat. No. 558617) (pseudo-colored purple), Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-GM130 (Cat. No. 558712) (pseudo-colored red). DAPI (Cat. No. 564907)는 핵 카운터 스테인 (pseudo-colored blue)으로 사용되었습니다. 슬라이드는 ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific)로 장착되었고 이미지는 BD Pathway 435 세포 분석기에서 캡처되고 BD Attovision Software (BD Biosciences)를 사용하여 병합되었습니다. 20X objective 배율

 
Grid of 6 fluorescence results for BV480
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Multicolor immunofluorescence staining of human embryonic stem cells

H9 인간 ES 세포주에서 배양된 세포를 BD Cytofix ™ 고정 buffer(Cat. No. 554655)으로 고정하고, 1X PBS에 희석된 0.1 % Triton ™ X-100으로 투과시키고, 5 % 염소 혈청, 1 % BSA로 차단하고 0.5 % Triton ™ X-100을 1X PBS에 희석 및 BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) Mouse Anti-SSEA-1 (Cat. No. 562705), BD Horizon Brilliant Violet ™ 480 (BV480) Mouse Anti-CD324 (E-Cadherin) (Cat. No. 565646), Alexa Fluor® 488 Mouse Anti-Oct3 / 4 (Cat. No. 561628), Alexa Fluor® 555 Mouse Anti-Human Ki-67 (Cat No. 558617)로 염색했습니다. DRAQ5 ™ (Cat. No. 564902)는 핵카운터 스테인으로 사용되었습니다. 슬라이드를 ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific)로 장착하고 이미지를 BD Pathway 435 Cell Analyzer (epifluorescence microscope)에서 캡처하고 BD Attovision Software 사용하여 병합했습니다. 20X objective 배율

 
Various fluorescence results for multiple tests.
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Compatibility of BD Horizon™ BV480 with BD Horizon™ BV421 for immunofluorescence imaging

세포: H9 인간 배아줄기세포 (WiCell, Madison WI). 고정 : BD Cytofix ™ 고정  buffer(Cat. No. 554655); 펌(perm): BD Phosflow ™ Perm Buffer III (Cat. No. 558050), Block / Stain : 5 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.5 % Triton ™ X-100 in 1X PBS. 항체 : Purified Mouse Anti-Oct3 / 4a (Cat. No. 561555) with BD Horizon Brilliant Violet ™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No. 564877), BD Horizon Brilliant Violet ™ 421 (BV421) Mouse Anti- 인간 TRA-1-60 항원 (Cat. No. 562711). 기타 시약 : DRAQ5 ™ (BioStatus), ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). 장비: BD Pathway 435 Cell Analyzer 및 BD Attovision Software (BD Biosciences)를 사용하여 병합된 이미지. 20X objective 배율

 
Spectra for BV480 results.
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연구용입니다. 진단용 또는 치료용으로 사용할 수 없습니다.

Alexa Fluor는 Life Technologies Corporation의 상표입니다.  ProLong은 Thermo Fisher Scientific의 상표입니다. 

DRAQ5는 BioStatus Limited의 상표입니다. ImageXpress는 Molecular Devices의 상표입니다. Triton은 Dow의 상표입니다.