Image showing sets of test tubes used for experiments.

Apoptosis 와 cell death

Overview

Apoptosis는 세포 재생을 위해 세포가 자기 스스로 파괴하거나 비정상적인 세포 성장을 제어하도록 신호를 보내는 과정입니다. 세포가 손상되거나 더 이상 필요하지 않으면 apoptosis 또는 programed cell death를 겪는데 이는 배아 발달 및 조직 항상성이 유지되는 동안 발생하는 정상적인 생리학적 과정입니다. Apoptosis는 손상된 세포의 질서 정연한 죽음을 제어하는 반면, necrosis는 손상된 세포와 주변 세포 모두의 손실을 유발하여 조직을 손상시키는 결과를 가져옵니다.

Apoptosis 과정

Apoptosis 과정은 특정 형태학적 특징을 나타내는데 원형질막의 변화 (예: 막 대칭 상실 및 막 부착 상실), 세포질과 핵의 응축, 단백질 절단 및 DNA의 nucleosomal 간 절단이 포함됩니다. 이 과정의 마지막 단계에서 죽어가는 세포는 세포 사멸체(apoptotic bodies)로 쪼개지고, 결과적으로 주변 세포에 대한 심각한 염증성 손상 없이 식세포에 의해 제거됩니다.

그러나 일부 세포 유형은 apoptosis의 특징을 보이지 않습니다. 이러한 경우 apoptosis 메커니즘을 확인하기 위해 세포 죽음의 여러가지 측면에 대한 분석이 필요할 수도 있습니다.

이러한 다양한 요구 사항을 지원하기 위해 BD Biosciences는 apoptosis 과정의 여러 단계에서 지표를 측정할 수 있도록 유세포 분석, 바이오 이미징 및 현미경 (살아있는 세포 및 고정 세포 분석 용) 뿐만 아니라 ELISA, IHC , western blotting 및 분광형광측정법 등의 측정 tools와 기술을 제공합니다.

Diagram showing apoptosis of external phosphatidylserine.

Diagram showing the cellular process and steps for apoptostis compared to cell viability.

세포 준비 과정별 apoptosis 또는 dead cells(생존률) 확인 방법

Apoptosis Detection Methods

다양한 세포 또는 조직에서 apoptosis를 확인하는 방법

Annexin V-apoptosis 신호전달의 핵심 단백질

원형질막의 변화는 살아있는 세포에서 발견되는 세포 사멸 과정의 특징 중 하나입니다. Apoptosis는 일반적으로 원형질막의 세포질 표면에 위치한 phosphatidylserine(PS) 확인으로 측정하는데, apoptosis가 진행되는 동안 PS는 원형질막의 외부로 이동하며 칼슘이 존재할 때 형광 표지 된 annexin V에 결합하여 유세포 분석 및 세포 이미징에 의해 측정될 수 있습니다.

BD Biosciences는 FITC, PE, violet laser용 BD Horizon ™ BV421 및 UV laser용 BD Horizon ™ BUV395와 같은 다양한 형광이 결합된annexin V를 제공합니다. 다양한 형광이 추가됨에 따라 이질적인 세포 하위집합 내에서 apoptosis를 관찰하기 위한 보다 복잡한 assays를 개발할 수 있습니다.

원형질막이 손상되면 세포 내 annexin V도 노출되기 때문에 7-AAD와 같은 막 불투과성 염료는 사멸한 세포를 제외하기 위해 apoptosis와 사멸한 세포를 구분하는데 사용됩니다. 7-AAD는 사멸한 세포에 염색이 되고, annexin v는 apoptosis 세포에 염색이 되어 apoptosis와 cell death구분하는데 사용됩니다.

Result of control Annexin V BD Horizon™ V450.

Result of low RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.

Result of high RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.

무선 주파수 선량(Radio frequency dose)에 따른 apoptosis, necrosis, cell death를 Annexin V-BD Horizon ™ V450 으로 확인. 저농도 cetuximab 표적 금 나노 입자로 처리한 췌장암에서 확인. 무선 주파수 파워가 증가함에 따라 온도가 상승하고 apoptosis(오른쪽 아래 사분면)에서 necrosis(왼쪽 위 사분면)로 이동이 관찰됨.

절단된 caspase 및 PARP 측정

Apoptosis의 특징 중 가장 일관되게 관찰되는 특징 중 하나는 caspase라고 불리는 일련의 proteases의 활성화입니다. Caspase는 apoptosis의 초기 단계에 aspartate 잔기의 절단이 일어나며 활성화됩니다. 활성 caspase는 poly -ADP 리보스 중합 효소 (PARP), 기타 caspase및 기타 단백질 기질을 포함하여 많은 단백질을 한꺼번에 절단할 수 있습니다. 이것은 세포 구조와 기능의 손실로 이어지고 궁극적으로 세포 사멸을 초래합니다. Caspase-9, -8 및 -3은 apoptosis와 관련이 있는데 미토콘드리아 경로는 caspase -9, Fas / CD95 경로는 caspase -8, 그리고 여러 경로에 의해 활성화된 caspase-3는 apoptosis downstream 에 관여합니다.

BD Biosciences는 caspase, 특히 caspase -3을 측정하기 위한 다양한 시약을 제공합니다. 유세포 분석, 이미징, ELISA 및 western blotting에 사용할 수 있는 활성 형태의 caspase에 대한 항체를 제공합니다.

BD Biosciences는 개별 형광 peptide 기질 및 억제제부터 키트, 즉시 사용 가능한 assay 플레이트에 이르기까지 caspase 활성 분석을 위한 다양한 도구도 제공합니다. 사람 또는 마우스의 활성 caspase에 의한 단백질 분해 절단은 발형광(fluorophore) 또는 발색단(chromophore)을 방출하는 합성된 tetrapeptide 기질 사용을 기반으로 합니다. 합성된 tetrapeptide 기질은 caspase 억제제 및 활성 caspase 효소와 함께 caspase 활성 분석의 실험 설계에 유연성을 제공합니다.

Diagrams showing stages of cleavage and inhibition.

BD는 또한 유세포분석을 통해 살아있는 세포에서 caspases 활성을 확인하는 시약을 제공합니다. 이 시약은 세포 투과성이 있기 때문에 세포를 고정할 필요가 없으며, 고정하지 않은 시료와 직접 배양하여 caspase 활성을 빠르게 측정할 수 있습니다.

항-활성 caspases-3를 이용한 apoptotic과 nonapoptotic 세포의 유세포분석.

Jurkat T 세포 (A, A1) 또는 마우스 흉선 세포 (B, B1)는 시약을 처리하지 않고 (A, B) camptothecin (A1) 또는 마우스 Fas 단일클론항체인 클론 Jo2 (Cat. No. 554254)로 4 시간 동안 처리하여 apoptosis를 유도한 후에 세포를 투과(permeabilization)한 다음 PE 표지 활성 caspases-3 항체 (Cat. No. 557091)로 염색했습니다. 시약을 처리하지 않은 세포는 활성 caspases -3가 음성으로 나왔지만, apoptosis를 유도한 것은 세포 집단의 약 절반 정도는 활성 caspases -3를 가지고 있었습니다.

Data showing relative cell number of untreated and treated cells using camptothecin and mous Fas mAb.

전체적인 그림 보기

Caspase와 annexin V 외에도 Bcl-2 계열, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 계열, PARP 및 기타 신호 분자를 포함하여 apoptosis 연구에 중요한 몇 가지 단백질이 있습니다.

Bcl-2 상동성 (BH3) 도메인을 가지고 있는Bcl-2 계열은 apoptosis의 핵심 조절자입니다. 예를 들어 Bcl-2는 미토콘드리아 막과 결합하고 미토콘드리아에서 cytochrome c의 방출을 막아 apoptosis로부터 세포를 보호합니다. 이와는 대조적으로 Bax와 같은 다른 Bcl-2계열은 apoptosis를 촉진하고 암에서 Bcl-2의 발현이 증가됨이 보고되었습니다.

TNFR 계열은 구조에 따라 세 가지 주요 그룹으로 나눌 수 있는 CD95를 비롯한 많은 member를 포함하고 있습니다. TNFR 경로를 통한 신호는 apoptosis를 유도합니다.

PARP는 DNA 가닥 파손에 의해 활성화되는 DNA 복구 효소입니다. Caspase-3는 PARP를 24- 및 89-kDa 단편으로 만들고 PARP 효소를 비활성화 시킵니다.

BD Biosciences는 apoptosis의 유용한 마커인 PARP의 cleaved 형태에 특이적인 항체를 제공합니다. 이러한 항체는 다양한 형광제품으로 제공되며 다른 마커와 함께 염색하여 세포에 대한 추가 정보를 얻을 수 있습니다.

Apoptosis Tools and Resources

Apoptosis 연구를 간소화하는 BD Biosciences의 tools

특정 cytokine, 단백질-단백질 상호 작용 및 화학 물질 등 apoptosis를 유발하는 인자들이 있습니다. Apoptosis가 시작되면 BD^® MitoScreen (JC-1) Flow Cytometry Kit 또는 BD Pharmingen ™ MitoStatus Dyes를 사용하여 유세포 분석으로 미토콘드리아 막 전위의 변화를 측정할 수 있습니다. 미토콘드리아 막 전위의 감소는 미토콘드리아 막 투과성을 증가시키고 cytochrome c 및 pro caspases와 같은 단백질의 방출을 유도합니다.

DNA 단편화(fragmentation)는 apoptosis 과정에서 endonucleases 활성화로 인한 apoptosis 마지막 단계 중 하나입니다. Agarose gel겔 전기영동 및 말단 라벨링에 의한 DNA 단편의 추출 및 분리를 포함하여 DNA 단편화 연구를 위한 몇 가지 확립된 방법이 있습니다. BD^® APO-BrdU ™ 키트는 DNA 단편화 연구를 위해 말단 라벨링 또는 말단 deoxynucleotide 전달효소(TdT)를 이용한 nick end라벨링 (TUNEL 방법)을 사용합니다. 이 assay에서 TdT는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA의 3'- hydroxyl (OH) 말단에 bromolated deoxyuridine triphsphate (Br-dUTP)붙게 촉매 작용을 합니다. Br-dUTP가 붙은 이중 및 단일 가닥 DNA의 말단 부위는 형광 표지 anti-BrdU로 세포를 염색하여 유세포 분석을 합니다. 이와는 대조적으로, BrdU proliferation assay는 BrdU를 새로 합성된 DNA에, DNA 가닥 절단 부위에 통합합니다.

Apoptosis가 끝나면 세포는 생존할 수 없게 됨으로 necrosis또는 dead cell과 apoptosis를 구별하는 것은 중요합니다. BD는 esterase 활성 probe및 막 무결성 염료 등 죽은 세포를 식별하기 위한 다양한 viability 제품을 제공합니다.

측정 된 기능	Assays	주요 특징
플라즈마 막 변경 (phosphatidylserine 노출)	Annexin 결합 assay · 단일 접합체 · Annexin V 키트	초기 apoptosis marker 확인 빠르고 쉬움 유세포 분석 또는 면역형광법 적용
형광분석법에 의한 caspase 활성화	caspase 활성 assay 키트 및 시약	빠르고 쉬움
면역분석에 의한 caspase활성화	활성 caspase -3 접합체를 포함한 활성 caspase -3 면역 분석	고정 세포 또는 용해된 조직의 세포 조직에서 ELISA, 유세포 분석 또는 western blotting
살아있는 세포 활동 probe에 의한 caspase 활성화	활성 caspase -3 살아있는 세포 caspases probe : Yellow-Green Live Cell Caspase Probe BD Pharmingen™ Blue Live Cell Caspase Probe BD Pharmingen™ Violet Live Cell Caspase Probe BD Pharmingen ™ Violet Live Cell Caspase probe	유세포 분석 손상되지 않고 고정되지 않은 세포에서 caspases 활성 측정 가능
주요 단백질 활동	주요 신호 단백질 접합체 : 절단 된 PARP Bcl-2 CD95 H2AX	유세포 분석, western blotting, 면역 조직화학법 및 면역형광법에 사용 가능 다양한 형식으로 이용 가능하여 관심 집단의 더 나은 특성화를 위해 다른 apoptosis 및 viability 도구와 함께 multiplexing 가능
Mitochondria 변화	BD^® MitoScreen Kit BD Pharmingen™ MitoStatus TMRE BD Pharmingen™ MitoStatus Red	유세포 분석 또는 형광 현미경을 통한 빠르고 쉬운 단세포 resolution
DNA fragmentation(단편화)	APO-BrdU™ TUNEL Assay APO-DIRECT™ TUNEL Assay	유세포 분석에 의한 세포주기 분석과 함께 adherent 세포, 단세포 resolution과 함께 작동
Esterase 활성	BD Pharmingen™ Calcein AM BD Pharmingen™ Calcein Blue AM	유세포 분석을 통해 손상되지 않은 고정되지 않은 세포의 생존율 측정
핵산 검출에 의한 막 무결성	Propidium Iodide 7-AAD DAPI DRAQ7 ™ BD Via-Probe™ Green Nucleic Acid Stain BD Via-Probe™ Red Nucleic Acid Stain	염료가 투과할 수 있는 죽은 세포의 핵산을 염색하여 유세포 분석을 위한 손상되지 않고 고정되지 않은 세포의 생존율을 측정 간편한 패널 설계를 위해 여러 레이저 라인에 사용 가능
염료 제외로 인한 막 무결성	BD Horizon™ Fixable Viability Stains	온전한 세포의 표면과 죽은 세포의 표면 및 내부를 염색하여 유세포 분석을 위한 고정 세포의 생존율 측정 간편한 패널 설계를 위해 10 가지 색상으로 제공

사용할 수 있는 기법과 제품이 너무 많기 때문에 가장 적합한 방법을 찾는 것이 어려운 경우도 있습니다. 선택을 용이하게 할 수 있도록 위의 표에서 생물학적 관점에서 이용 가능한 assays를 요약했습니다.

Apoptosis, cell cycle 및 DNA 손상의 동시 연구

Apoptosis및 세포 증식 assays는 특히 기본적인 암 연구 및 약물 발견에 유용합니다. 시료 처리, 시점, 시료 내 가변성으로 인해 발생하는 변동으로 여러 실험에서 나온 데이터를 비교하는 것이 어려울 수 있습니다.

Multicolor 유세포 분석은 이러한 문제를 해결하고 apoptosis 및 세포 증식을 연구할 수 있는 훌륭한 tools입니다. 관련 마커를 세포 표현형 마커와 결합하여 세포 하위 집단 내의 현상을 볼 수 있습니다. 인단백질에 대한 항체는 인산화를 조사하는데 사용할 수 있습니다.