Assessoria Científica BD A Equipe é Formada por Profissionais
A equipe é formada por profissionais da área Biológica e/ou Saúde, com Mestrado e/ou Doutorado e recebem constantes treinamentos nas diversas aplicações da técnica de citometria de fluxo.
Conheça 6 dicas “Brilhantes” para solucionar problemas comuns nos experimentos de citometria de fluxo e contribuir para obter melhores resultados em seu painel multicolor.
A equipe de assessoria científica da BD é formada por profissionais da área Biológica e/ou Saúde, todos com Mestrado e/ou Doutorado e recebem constantes treinamentos nas diversas aplicações da técnica de citometria de fluxo. Eles separaram 6 dicas "Brilhantes" para ajudar a solucionar problemas comuns nos experimentos de citometria de fluxo e contribuir para melhores resultados em seus experimentos.
- Conheça a biologia das populações de interesse
- Escolha os melhores fluorocromos de acordo com a configuração óptica do seu equipamento
- Classifique os antígenos investigados e escolha os fluorocromos baseado em suas características de expressão
- Não esqueça dos ajustes instrumentais e compensação
- Otimize o seu painel
- Sempre utilize marcadores de viabilidade
A obtenção de resultados de alta qualidade em citometria de fluxo depende de diversos fatores. Baixa resolução das populações de interesse, alta sobreposição de espectros, alto background e dificuldade nos ajustes instrumentais são alguns dos problemas mais comuns encontrados por usuários da citometria de fluxo multiparamétrica. Abordar cada um destes fatores de maneira apropriada garantirá resultados com melhor identificação das populações de interesse, maior resolução das marcações realizadas e, finalmente, maior assertividade e confiabilidade das conclusões obtidas.
1) Conheça a biologia das populações a serem estudadas
O painel de citometria de fluxo multicolor tem início muito anterior, com a elaboração da hipótese biológica e desenho experimental. Conheça o mais profundamente possível as células a serem estudadas e suas peculiaridades, pois é um critério fundamental para uma boa identificação das mesmas. Utilize pesquisas bibliográficas e experiências anteriores para elaborar um quadro geral capaz de lhe proporcionar uma visão geral de todas as células de interesse naquela amostra, a frequência de cada uma delas, a expressão e coexpressão das moléculas a serem investigadas para obter as informações necessárias que lhe darão subsídio para a correta escolha dos reagentes.
2) Escolha os melhores fluorocromos de acordo com a configuração óptica do seu equipamento
Os diferentes fluorocromos disponíveis não são todos iguais e, de acordo com a configuração óptica do equipamento utilizado, podem se tornar escolhas mais adequadas. Conhecer o equipamento que será utilizado, quais lasers e canais disponíveis é o primeiro passo para fazer a melhor escolha possível dos fluorocromos a serem utilizados. Atualmente, os diferentes equipamentos são capazes de ler uma gama muito diversificada de fluorocromos. Tirar o máximo proveito desta capacidade, espalhando os fluorocromos pelos lasers e canais de fluorescência do citômetro de fluxo, é um importante passo para obter resultados de alta qualidade. Se você tem dúvidas sobre os filtros disponíveis no seu equipamento, quais fluorocromos podem ser utilizados e quais apresentam melhor performance, clique aqui e saiba mais. A BD Biosciences possui o maior e mais completo portifólio de fluorocromos do mercado, conheça mais sobre os reagentes da linha BD Horizon Brilliant™, os mais brilhantes e estáveis atualmente disponíveis no mercado.
3) Classifique os antígenos investigados e escolha os fluorocromos baseado em suas características de expressão
Assim como os fluorocromos apresentam índices de brilho diferentes, os antígenos investigados também são diferencialmente expressos nas células estudadas. Uma regra fundamental do desenvolvimento de painéis multicolor é juntar estas duas informações, privilegiando o uso dos fluorocromos mais brilhantes para as moléculas menos expressas e/ou células mais raras e deixando aquelas de maior expressão em fluorocromos com índices de brilho menores. Este raciocínio inicial foi profundamente desenvolvido e pode ser melhor explorado em nossos seminários online. Facilite a confecção de um painel multicolor com diversos reagentes usando ferramentas online que auxiliam a visualização dos reagentes disponíveis e compatibilidade com plataformas específicas, como o BD FACSelect™ Multicolor Panel Designer.
4) Não esqueça dos ajustes instrumentais e compensação
A estruturação do experimento, estudo das células e a escolha dos melhores reagentes de nada valerão se a aquisição dos dados não for a ideal. É fundamental que o citômetro de fluxo tenha um desempenho comprovadamente ideal. A utilização dos controles de qualidade instrumentais recomendados, o correto ajuste de voltagens dos canais de fluorescência, se necessário, e a utilização dos controles de compensação apropriados são pontos críticos para obtenção de dados de qualidade. A escolha de fluorocromos de baixa qualidade ou inapropriados gera altos níveis de background de fluorescência e sobreposição de espectros, diminuindo drástica e irreversivelmente a resolução dos dados gerados. Utilize ferramentas que permitam a confecção de controles de compensação adequados, por exemplo com beads que permitam obter marcações individuais de alta intensidade de brilho. Visualize a interferência dos espectros de emissão sobre os canais colaterais usando nossa ferramenta online e gratuita BD Spectrum Viewer.
5) Otimize o seu painel
Após toda esta pesquisa e trabalho terem sido realizados, agora é hora de validar e otimizar o seu painel. Variáveis como titulação dos reagentes, protocolos de marcação, armazenamento da amostra, entre outros, são grandes interferentes da qualidade dos dados. Apesar dos anticorpos já trazerem volumes/concentrações de uso sugeridos, a titulação dos mesmos é primordial para ajustar o desempenho do reagente às necessidades e particularidades da sua amostra. Igualmente, protocolos de marcação podem parecer detalhes menores do processo como um todo, mas frequentemente são responsáveis por grandes problemas nas marcações. Degradação de determinados fluorocromos por alguns tipos de fixadores e permeabilizantes, pH das soluções, temperatura de utilização, qualidade da água utilizada, variação nas formulações não comerciais e baixa qualidade, mau armazenamento e prazo de validade experiado dos reagentes são apenas alguns dos interferentes comuns que podem colocar todo seu ensaio a perder. Não corra riscos desnecessários e garanta reprodutibilidade e padronização ao seu experimento, utilize soluções testadas e validadas que minimizem estes interferentes e tragam maior segurança e qualidade.
6) Sempre utilize marcadores de viabilidade
Os diferentes processos de marcação, estímulo, incubação, lavagem, fixação, permeabilização e retirada das células da cultura são apenas alguns dos procedimentos comumente realizados nos experimentos de citometria de fluxo. Naturalmente, algumas células podem sofrer diferentes estresses e danos perante estes processos e morrerem. Sabidamente, a presença de células mortas contribui para o aumento do background de fluorescência, ligações inespecíficas, além de inserir inúmeros outros interferentes analíticos aos dados adquiridos. Atualmente, estão disponíveis marcadores de viabilidade em diversos canais de fluorescência para os lasers mais comuns em citometria de fluxo. Compatível com protocolos de fixação e permeabilização, criopreservação e procedimentos overnight, a linha de marcadores BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS) apresenta importantes diferenciais e maior tempo de validade quando comparado a outras opções disponíveis no mercado.
