Entrevista Edgar J. P. Gamero
1) Professor, há quanto tempo você trabalha com citometria de fluxo e qual principal interesse na técnica?
Prof. Dr. Edgar: Iniciei os trabalhos com Citometria de Fluxo a partir da implantação da plataforma multiusuário do INFAR em 2000, contando com um BD FACSCalibur™*. Desde então, as aplicações da metodologia foram focadas principalmente em morte e ativação celular, analisando vias de sinalização e fosforilação de proteínas.
Naquela época, trabalhávamos com apenas um marcador por vez, utilizando marcações primária e secundária. Não havia muitos anticorpos conjugados para proteínas fosforiladas, em 2004 os primeiros trabalhos haviam sido recentemente publicado, e o portfólio de anticorpos era restrito e não haviam kits comerciais.
2) Mesmo diante destas limitações na época, vocês persistiram na Citometria de Fluxo ao invés do clássico Western-Blot como método para análise de proteínas fosforiladas. O que vocês já enxergavam de vantagem nesta abordagem?
Prof. Dr. Edgar: Inicialmente identificávamos receptores purinérgicos em populações hematopoiéticas, como neutrófilos, monócitos e linfócitos. Como utilizávamos amostra de medula óssea (populações heterogêneas e em diferentes fases de diferenciação) a perspectiva de multiparametrização e análise de vias em tipos celulares específicas sempre foi uma possibilidade muito interessante para o nosso grupo. Este tipo de estudo por Western-Blot ou seria impossível, ou tecnicamente muito difícil, já que requer um número de células muito maior, uma grande limitação para o trabalho com populações raras, por exemplo. Você nunca vai ter meio milhão de células de progenitores hematopoéticos para realizar um Western-Blot. Assim, a citometria de fluxo, além de apresentar muitas vantagens metodológicas em si, como menor tempo de duração do ensaio e requerer menor número de células, é a metodologia capaz de nos entregar os resultados que precisamos em mais de uma via de sinalização simultânea, nos diversos tipos celulares.
3) Mas acredito que os protocolos tenham sofrido algumas alterações e atualizações desde então, não? Poderia nos contar como foi a evolução da metodologia nos últimos anos?
Prof. Dr. Edgar: Em 2004, existiam poucos anticorpos para proteínas fosforiladas já conjugados para citometria de fluxo. Os primeiros a aparecerem eram para ERK, Akt e outras vias clássicas. Começamos então a testá-los e percebemos que os resultados já eram melhores que utilizando anticorpos primários e secundários. Além disso, as soluções de permeabilização e fixação também evoluíram com o passar dos anos. Inicialmente a única opção eram tampões feitos “ in-house” com formulações à base de detergentes como saponina e Triton X-100 ou etanol, que nos deram bons resultados. Recentemente, a partir da parceria com a BD, iniciamos os testes das soluções e tampões disponibilizados pela empresa, pré-validados e testados para diferentes tipos de proteínas. Os resultados com os tampões da BD foram ótimos, sendo a maior vantagem observada a reproutibilidade superior em relação aos tampões formulados no próprio laboratório, além da melhor marcação proporcionada. Em resumo, pelas diferentes fases que passamos, percebemos a diferença de qualidade e reprodutibilidade dos dados substituindo as marcações primárias e secundárias por anticorpos já conjugados, bem como com a troca de tampões formulados no laboratório pelos kits de soluções e tampões BD .
4) E como os dados são recebidos pela comunidade científica, menos habituada a Citometria de Fluxo para este tipo de ensaio?
Prof. Dr. Edgar: Quando submetíamos os trabalhos frequentemente éramos questionados, ocasionalmente ainda somos. Nós já temos diversas respostas padrões, ressaltando os motivos pelos quais decidimos pela adoção da Citometria de Fluxo, bem como suas vantagens sobre o Western-Blot. Às vezes, nos pedem dados de validações dos anticorpos, por exemplo, mostrando a marcação de proteínas fosforiladas, o que fazemos facilmente com controles positivos, que são igualmente necessários em qualquer outra metodologia. Notamos que revistas de alto impacto, como a Blood e a Cell, já compreendem muito bem o motivo de se utilizar a citometria de fluxo e suas vantagens sobre o Western-Blot, em especial em populações raras.
Estratégias de marcação de proteínas fosforiladas por diferentes protocolos para citometria de fluxo.
5) Dr. Edgar, recentemente vocês adquiriram um BD FACSAria™ III. Em que este equipamento contribuiu para o grupo e quais perspectivas atuais?
Prof. Dr. Edgar: O BD FACSCalibur™* que já possuíamos é suficiente para uma grande diversidade de aplicações. Mas para populações diversas, é interessante trabalhar com mais cores. A partir da maior multiparametria que temos no BD FACSAria™ III, com mais lasers e canais, abrem-se ótimas perspectivas e vatanges. Assim, estabelecemos diversas colaborações para o isolamento celular e, especificamente em nosso estudo, conseguimos utilizar menores volumes de amostra, analisar mais vias simultaneamente e investigar melhor as interações de vias de sinalização em células-tronco hematopoiéticas e cancerígenas. Agora que estamos mais habituados e com maior estabilidade nos isolamentos celulares, pretendemos em breve realizar o single-cell sorting, isolando células únicas para nossos estudos.
6) A partir da aquisição do BD FACSAria™ III houve maior proximidade empresa-laboratório, qual impacto disto no trabalho do grupo?
Prof. Dr. Edgar: A presença da BD tem beneficiado bastante nosso grupo. Principalmente para equipamentos mais complexos como o BD FACSAria™ III, o respaldo e resposta rápida da empresa é de suma importância. A proximidade auxilia permite a possibilidade de dar feedbacks para a empresa sobre nossas demandas. A presença de um time de serviço bem consolidado no Brasil facilita para cobrar uma resposta e obtê-la rapidamente. Na área científica, a presença atuante da equipe de assessoria científica, fazendo o seguimento conosco dos estudos e técnicas é certamente um diferencial. Na citometria de fluxo, estão sempre sendo implementados novos protocolos e metodologias. A proximidade da assessoria científica é bastante importante para permitir que os pesquisadores mantenham-se atualizados com os novos produtos e possibilidades disponibilizados na área.