Assessoria Científica BD

A equipe de assessoria científica da BD é especialista em diversas aplicações da técnica de citometria de fluxo. Eles separaram uma dica para garantir a acurácia dos resultados no painel multicolor

Dica para garantir a acurácia dos resultados no painel multicolor

1. Por que é importante excluir células mortas das análises em citometria de fluxo?
2. O que são os BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS)?
3. Para quais canais de fluorescência exixtem BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS)?

A presença de células mortas em amostras analisadas por Citometria de Fluxo pode afetar significativamente a qualidade da marcação e aumentar inespecificidade de ligação dos anticorpos, gerando resultados falso-positivos e diminuindo a resolução dos dados. Isso pode dificultar a discriminação de células raras e antígenos de baixa expressão.

Enquanto gates baseados em forward e side scatter auxiliam na exclusão de debris e células mortas, essa estratégia não irá eliminá-las por completo da análise. A inclusão, no painel multicolor, de um marcador de viabilidade celular tem se estabelecido como prática comum em Citometria de Fluxo para comprovar a acurácia dos resultados.
Atualmente, estão disponíveis marcadores de viabilidade em diversos canais de fluorescência para os lasers mais comuns em citometria de fluxo. Compatível com protocolos de fixação e permeabilização, criopreservação e procedimentos overnight, a linha de marcadores BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS) apresenta importantes diferenciais e maior tempo de validade quando comparado a outras opções disponíveis no mercado.

1) Por que é importante excluir células mortas das análises em citometria de fluxo?

Células mortas podem ser um grande interferente nas análises por Citometria de Fluxo:

• Anticorpos e sondas se ligam inespecificamente às células mortas.
• Células mortas podem apresentar uma maior autofluorescência.
• Células podem mascarar resultados de ensaios funcionais.
• Células podem mascarar resultados de ensaios funcionais.
• Células mortas reduzem a qualidade da amostra e diminuem a estabilidade da aquisição (ex.: presença de mais agregados celulares).
  
   

PBMCs não estimulados foram avaliados para expressão de IL-17. A figura da esquerda indica que células não estimuladas marcadas com o isotipo controle do anticorpo anti-IL-17 não expressam IL-17 (gate em células viáveis CD3+CD4+. Quando, na mesma amostra, não é incluída na estrategia de análise a exclusão de células mortas, pode-se observar a presença de eventos falso-positivos devido à ligação inespecífica do isotipo controle.

Esses fatores aumentam o background de fluorescência e diminui a resolução, reduzindo a habilidade de visualizar, sobretudo, moléculas pouco expressas e populações celulares raras. É importante minimizar células mortas antes da aquisição (qualidade, preparo e armazenamento da amostra) e, excluí-las na análise pós-aquisição inserindo no painel multicolor marcadores de viabilidade

2) O que são os BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS)?

Marcadores amino reativos para análise de viabilidade em células frescas, fixadas ou permeabilizadas. Esse corante se liga às células viáveis e não viáveis. Em processos de morte celular, a célula capta uma maior quantidade de corante pois perde sua integridade de membrana. Dessa forma, as células não viáveis possuem maior intensidade de fluorescência do que as células viáveis. As células mortas podem ser excluídas da análise através da seleção por um gate das células de menor intensidade de fluorescência (células vivas). Os FVS foi validado com diversos tampões de fixação e permeabilização à base de detergentes e álcool, incluindo os tampões BD Biosciences, permitindo a análise de viabilidade em protocolos de marcações intracelular, como análise de citocinas, fatores de transcrição e proteínas fosforiladas.

3) Para quais canais de fluorescência existem BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS)?

Os BD Horizon™ Fixable Viability Stain (FVS) estão disponíveis para flexibilizar o design de panéis multicolor, existindo em diferentes opções de cores para ser melhor adaptado a cada experimento. Veja abaixo as opções disponíveis em nosso portfólio.