T細胞研究

様々な細胞サブセット

Th細胞サブセット極在条件下での細胞内サイトカイン解析
Th1, Th2, Th9, Th17及びiTreg細胞サブセット極在条件下での細胞内サイトカイン解析

末梢血単核細胞(PBMC)は、14 日間Th1, Th2, Th9, Th17及び iTreg極在条件下で培養し、BD GolgiStop™ タンパク輸送阻害剤(monensin, Cat. No. 554724)存在下にてPMA/イオノマイシンで5時間再刺激した。 細胞は、BD Cytofix™ fixation buffer (Cat. No. 554655)で固定、BD Perm/Wash™ buffer (Cat. No. 554723)で膜透過を行い、BD Pharmingen™ 抗体で染色した。抗体は抗CD4抗体及び、細胞内サイトカインIL-9, IFN-γ, IL-4, IL-17Aに対する抗体を用いた。ドットプロットは、リンパ球でゲートしたものを示す。なお、BD™ LSR II フローサイトメーターで測定を行った。

健常者のヒトPBMCは全血からFicoll-Paque™ Plusを用いて採取し、プレート結合した抗CD3 (10 µg/mL)及び抗ヒトCD28 (1 µg/mL) 、リコンビナントサイトカイン(10 ng/mL)を用いて各々以下の条件下で 刺激培養を行った。:

  • TH1, IL-12 (50 ng/mL) 及び中和抗体ヒト IL-4 (10 µg/mL)
  • TH2, IL-4 (50 ng/mL)及び中和抗体IFN-γ (10 µg/mL)
  • TH17, IL-6 (50 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), TGF-β (10 ng/mL)及び中和抗体IFN-γ (10 µg/mL) IL-4 (10 µg/mL)
  • iTreg, TGF-β (10 ng/mL) 及び中和抗体IFN-γ (10 µg/mL) and IL-4 (10 µg/mL)
  • TH9, IL-4 (50 ng/mL), TGF-β (10 ng/mL) 及び中和抗体IFN-γ (10 µg/mL)
CD4+ 及びCD8+ T 細胞における3種のサイトカイン同時解析
CD4+ and CD8+ T 細胞における3種のサイトカイン同時解析
凍結保存したPBMCはbrefeldin A存在下でSEB (1 µg/mL) 刺激を6時間行った。 活性化細胞はBD FACS™ lysing solution (Cat. No. 347691)で溶血、固定を行い、BD FACS™ Permeabilizing Solution 2 (Cat. No. 340973)を用いて洗浄、膜透過処理を行った。細胞は、以下の6色の抗体で染色を行った。BD FastImmune™ cytokine antibodies [TNF FITC (Cat. No. 340511), IFN-γ PE (Cat. No. 340452), IL-2 APC (Cat. No. 341116), CD8 PerCP-Cy™5.5 (Cat. No. 341051), CD4 PE-Cy™7 (Cat. No. 348789), 及びCD3 BD Horizon™ V450]で染色しBD FACSCanto™ II フローサイトメーターで測定した。ドットプロットはリンパ球でゲートし(FSC/SSC)さらにCD3+ で展開したものを示す。
naïve, memory及びeffector T 細胞 (part A)のサイトカイン発現解析
BD FastImmune プロトコルを用いたCD4+ 及び CD8+ T細胞サブセット のサイトカイン発現解析
ヒトPBMCは健常ドナーからCPTチューブを用いて採取し 、brefeldin A存在下でSEB (1 µg/mL) 刺激を6時間行った。 活性化細胞は、洗浄後CD3 APC-H7 (Cat. No. 641397), CD4 PerCP-Cy5.5 (Cat. No. 341654), CD8 BD Horizon V500™ (Cat. No. 560774), CD28 APC (Cat. No. 559770), CCR7 PE (Cat. No. 552176), 及びCD45RA PE-Cy7 (Cat. No. 337167)を用いて染色した。続いてBD FACS lysing solution (Cat. No. 347691)で固定し、洗浄、BD FACS Permeabilizing Solution 2 (Cat. No. 340973)で膜透過処理を行った。二回洗浄後、IFN-γ BD Horizon V450 (Cat. No. 560371), IL-2 FITC (Cat. No. 340448), TNF Alexa Fluor® 700 (Cat. No. 557996)染色し、special order BD LSR II セルアナライザーで測定した。ドットプロットはリンパ球でゲートし(FSC/SSC)さらにCD3+ 及びCD4+ 展開したものを示す。
naïve, memory及びeffector T 細胞 (part B)のサイトカイン発現解析
BD FastImmune プロトコルを用いたnaïve, memory及びeffector T細胞サブセット のサイトカイン発現解析
ヒトPBMCは健常ドナーからCPTチューブを用いて採取し 、brefeldin A存在下でSEB (1 µg/mL) 刺激を6時間行った。活性化細胞は、洗浄後CD3 APC-H7 (Cat. No. 641397), CD4 PerCP-Cy5.5 (Cat. No. 341654), CD8 BD Horizon V500™ (Cat. No. 560774), CD28 APC (Cat. No. 559770), CCR7 PE (Cat. No. 552176)及びCD45RA PE-Cy7 (Cat. No. 337167)を用いて染色した。続いて、BD FACS lysing solution (Cat. No. 347691で固定し、洗浄、BD FACS Permeabilizing Solution 2 (Cat. No. 340973)で膜透過処理を行った。二回洗浄後、IFN-γ BD Horizon V450 (Cat. No. 560371), IL-2 FITC (Cat. No. 340448)及びTNF Alexa Fluor® 700 (Cat. No. 557996)染色し、special order BD LSR IIセルアナライザーで測定した。 ドットプロットはリンパ球でゲートし(FSC/SSC)さらにCD3+ 及びCD4+展開したものを示す。

 
抗原特異的CD4+ IFN-γ 反応
Typical CD4 IFN-γ responses to three different antigens measured using the BD FastImmune cytokine system
Heparinized whole blood from seropositive individuals was restimulated with antigen and costimulatory antibodies (CD28 and CD49d) in the presence of the secretion inhibitor brefeldin A, fixed using BD FACS lysing solution (Cat. No. 347691), then washed and permeabilized with BD FACS Permeabilizing Solution 2 (Cat. No. 340973). Samples were analyzed using the BD FastImmune CD4 intracellular IFN-γ detection kit (Cat. No. 340970). Typical frequencies of IFN-γ–producing cells are shown for antigen-restimulated (+Ag) and unstimulated (–Ag) samples.
BD Pharmingen Transcription Factor Buffer Setを用いて異なる細胞調整を行ったフローサイトメトリーによる転写因子解析( Cat#562574)
BD Pharmingen Transcription Factor Buffer Setを用いて異なる細胞調整を行ったフローサイトメトリーによる転写因子解析( Cat#562574)
A ヒト制御性T細胞におけるFoxP3の発現
B Th17細胞極性下のBALB/CマウスにおけるRORgt及びIL-17Aの発現

 
 

Th17

細胞内サイトカイン解析(ヒトPBMC)

刺激したPBMCのPE抗ヒトIL-17Aによる解析

ヒトPBMCは、BD GolgiStop™ タンパク輸送阻害剤(monensin, Cat. No. 554724)存在下、PMA/イオノマイシンで5時間刺激した。 細胞は、固定後、BD Cytofix/Cytoperm™ reagents (Cat. No. 554714) 膜透過処理を行い、続いてPE 抗ヒトIL-17A抗体 (Cat. No. 560486)、Alexa Fluor® 647抗ヒトIFN-γ (Cat. No. 557729; 左パネル), APC 抗ヒトIL-4 (Cat. No. 554486; 右パネル)を用いて染色した。ドットプロットはCD4+ リンパ球でゲートしたものを示す。測定はBD FACSCalibur™セルアナライザーで行った。

Human Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kitを用いたTh17細胞解析
Human Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kitを用いたTh17細胞解析
PBMCは、3日間、リコンビナントIL-6, TGF-β, IL-1β, IL-23,中和抗体IFN-γ, IL-4存在下で抗CD3及び抗CD28モノクローナル抗体を用いて刺激した。採集した細胞はHuman Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kit (Cat. No. 560751)に従って染色を行いBD LSR IIフローサイトメーターで測定した。ドットプロットは、CD4+リンパ球でゲートしたものを示す。
IL-17AおよびIL-17F解析
BD Cytofix/Cytopermプロトコールを用いたIL-17AおよびIL-17F解析
Th17極在条件下で培養したヒト細胞を、BD Cytofix/Cytoperm™ プロトコールを用いてIL-17AおよびIL-17F解析を行った。Th17極在サイトカイン存在下で、タンパク輸送阻害剤BD GolgiStop (monensin, Cat. No. 554724) またはBD GolgiPlug™ (brefeldin A, Cat. No. 555029)と共に細胞を培養した。細胞をBD Cytofix/Cytoperm fixation/permeabilization solution (Cat. No. 554722) で固定および透過処理し、続いて細胞を抗CD4, IL-17A (Alexa Fluor® 647-conjugated, Cat. No. 560437)及びIL-17F (PE-conjugated, Cat. No. 561198)に対する抗体で染色後、マルチカラーフローサイトメトリーで検出しました。
Th17細胞の細胞内解析(時系列)
Th17細胞のIL-17A/IFN-γ/IL-4.発現レベル比較解析の代表例(時系列)
PBMCは、14日間、 リコンビナントIL-6, TGF-β, IL-1β, IL-23,中和抗体IFN-γ, IL-4存在下で抗CD3及び抗CD28モノクローナル抗体を用いて刺激した。 採集した細胞はBD GolgiStop (monensin)タンパク輸送阻害剤で処理後、BD Cytofix/Cytoperm buffer固定膜透過し、BD Pharmingen細胞内サイトカインに対する抗体で染色した。6日目に、IL-17Aを発現する細胞が有意な数認められ、細胞数は10日目まで増加し、その後横ばいであった。

 
Th17細胞培養の多項目サイトカイン定量解析

BD CBA Th1/Th2/Th17 Kitを用いたTh17細胞培養の多項目サイトカイン定量解析

全血より採取したCD4+ ヒトmemory T 細胞はプレート結合した抗CD3及びCD28のみ (青色)あるいは リコンビナントIL-23存在下 (オレンジ)で刺激した。(左). Naïve CD4+ 脾臓細胞は、プレート結合した抗CD3及びCD28のみ(青色) あるいはリコンビナントTGF-β及びIL-6 (オレンジ)(右)で刺激した。

Th17細胞極性下のBALB/CマウスにおけるRORgt及びIL-17Aの発現
Th17細胞極性下のマウス脾臓におけるRORgt及びIL-17Aの発現
アイソタイプ及び抗マウスRORγt PE抗体で染色を行った。 ヒストグラムは、Th17細胞極性下における、IL-17AおよびIFN-γ発現サブセットのRORγt発現解析。 BD LSRFortessa™ フローサイトメーターで測定を行った。
サイトカイン,転写因子, 細胞表面マーカーの同時検出による マウスTh17 細胞解析
サイトカイン, 転写因子, 細胞表面マーカーの同時検出による マウスTh17 細胞解析

BALB/cマウスの胸腺及び脾臓の細胞を採取後、細胞をCD44、CD62L及びCD196の胞表面マーカー特異抗体あるいはアイソタイプコントロールで染色した。BD Pharmingen transcription factor buffer setで細胞を固定膜透過処理後、RORγt、Foxp3、IL-17A及びIFN-γの得意抗体で細胞内染色を行った。

上方のパネルはIL-17A発現解析。RORγt, Foxp3 (Treg 転写因子) あるいは IFN-γ (Th1サイトカイン)との比較を示す。 胸腺においては、IL-17A+ RORγt+細胞がみとめられるが、IL-17AとFoxp3、あるいはIFN-γを共発現している細胞はほとんど認められない。 脾臓においてはIL-17Aを発現している細胞はわずかある。下方のパネルは、IL-17A産生細胞解析。脾臓では、IL-17A産生細胞は、CD44及びCD196 (CCR6) を共発現しているが、CD62Lを共発現している細胞はほとんど認められない。



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