細胞内フローサイトメトリー

マルチカラー解析は、各細胞集団に特異的なタンパク発現解析に最適です。

Th17のような細胞集団は、 各サブセットを特徴づける細胞表面マーカーと細胞内マーカーを組み合わせることで表現型を同定することができます。例えば、細胞表面マーカーとシグナル伝達タンパクの同時解析は、シグナル伝達反応の特徴を捉えることができます。


細胞表面染色は標準的な手法が確立されている一方で、細胞内染色は、タンパクの生物学的な特徴に左右されます。 したがって、細胞内での位置、他の分子との関係、安定性の違いによって、推奨される細胞調製や染色法が異なります。

例えば、サイトカインは典型的な分泌タンパクですが、BD GolgiStop™ (Monensin含有) あるいは BD GolgiPlug™ (Brefeldin A含有)といったようなタンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。その後、BD Cytofix/ Cytoperm™ fixation とpermeabilization solutionを用い緩やかな固定膜透過を行う簡単で標準的な手法で測定します。

サイトカインとは対照的に、転写因子は核内に局在していたりDNA等と結合していることがあります。また、Stat5のようにリン酸化を受けているタンパクは、ダイマーを形成しリン酸化エピトープ部位がマスクされていることもあります。 さらには、 フォスファターゼは他のタンパクを脱リン酸化し次々にシグナルを伝えるため、刺激処理をした細胞はすぐに固定する必要があります。目的とするエピトープへ抗体が適切にアクセスできるよう比較的強い膜透過処理を行います。


細胞内染色の基本的な原理

複数の細胞内タンパクを検出するには異なる条件が必要とされる場合もありますが、基本的な原理は同じです。すなわち、細胞は、固定・膜透過処理 (破線が膜を表しています。)を行い, 蛍光標識抗体で染色しフローサイトメトリーにより解析を行います。 分泌タンパクの測定では、タンパク分泌阻害剤で初めに処理をし細胞内に目的のタンパクを貯留します。


細胞内染色の基本的な原理

細胞は、固定・膜透過処理 (破線が膜を表しています。)を行い, 染色しフローサイトメトリーにより解析を行います。 分泌タンパクの測定では、タンパク分泌阻害剤で初めに処理をし細胞内に目的のタンパクを貯留します。

BD が提供する細胞内フローサイトメトリーの ツール

単一細胞レベルで、複数タンパクを同時に検出するには、フローサイトメトリーの技術は必須です。 BD は様々なキット、バッファー、プロトコールを提供しています。また、蛍光標識抗体を様々なバッファーや条件でテストしているため、研究に従事する時間やコストを削減することができます。


サイトカインの検出
BD Cytofix/Cytoperm fixation/permeabilization solution (Cat. No. 554722)は、様々なサイトカインを染色することに適しています。ホルムアルデヒドを用いたマイルドな固定を行いますので、いくつかの転写因子や細胞内タンパクと合わせて測定することもできます。

転写因子
BD Pharmingen™ transcription factor buffer set (Cat. No. 562574/562725) は、細胞表面マーカーと、様々な転写因子、サイトカインを複数組み合わせ測定することができます。ホルムアルデヒドを用いたマイルドな固定を行います。

リン酸化タンパクの検出
BD Phosflow™ perm buffer III (Cat. No. 558050)はフローサイトメトリーによる、リン酸化エピトープの検出に最適な膜透過剤です。 Perm buffer IIIは、アルコールを含むバッファーです。 また、実験系によってはPermeabilization bufferを代わりに使うことが できます。


Cell Perm - STAT phosphotyrosine epitopes

活性化した細胞において 、ダイマライゼーションすることでSTAT リン酸化チロシンエピトープはマスクされている。



エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

細胞膜透過処理は、細胞内でのエピトープの位置によって変化します。

フォスフォチロシン 701エピトープ (橙色) は、Stat二量体の内側にあり、フォスフォセリン727エピトープは、二量体の外側にあります。フォスフォチロシン 701は、膜透過性のより強いperm buffer IIIのようなバッファーが適切です。 リン酸化蛋白を誘導するために、ヒト末梢血単核細胞 (PBMCs)を 、ヒトIFN-α (Stat1 pY701)あるいはPMA (Stat1 pS727)で刺激処理を行い活性化した(+)。比較対象として、無刺激(–)サンプルをおいた。なお、リン酸化タンパク特異抗体で染色した後、BD Cytofix™ fixation bufferを使用して膜固定処理を行い 、BD Phosflow™ perm buffer I, II, III、あるいは IVを使用して膜透過処理を行った。


エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

細胞膜透過処理は、細胞内でのエピトープの位置によって変化します。

フォスフォチロシン 701エピトープ (橙色) は、Stat二量体の内側にあり、フォスフォセリン727エピトープは、二量体の外側にあります。フォスフォチロシン 701は、膜透過性のより強いperm buffer IIIのようなバッファーが適切です。 リン酸化蛋白を誘導するために、ヒト末梢血単核細胞 (PBMCs)を 、ヒトIFN-α (Stat1 pY701)あるいはPMA (Stat1 pS727)で刺激処理を行い活性化した(+)。比較対象として、無刺激(–)サンプルをおいた。なお、リン酸化タンパク特異抗体で染色した後、BD Cytofix™ fixation bufferを使用して膜固定処理を行い 、BD Phosflow™ perm buffer I, II, III、あるいは IVを使用して膜透過処理を行った。