細胞内フローサイトメトリー

免疫反応の一つ、活性化細胞によるサイトカインのような炎症性メディエーターの分泌は簡単に解析することができます。

ELISAやBD™ CBAのような手法は、細胞集団全体の分泌物質を測定する手法です。対照的に、細胞内フローサイトメトリーは、ヘテロな細胞集団の分泌物質を個々に測定することができます。


細胞内フローサイトメトリーによる、活性化細胞におけるサイトカイン産生能の解析は、非常に簡単で、標準的な手法が確立されています。これは、貴重な細胞集団がサイトカインを多量に産生している場合でも、細胞数の多い細胞集団がサイトカインを少量産生している場合でも同様です。さらには、転写因子などとも同時に測定することも可能ですので、各細胞サブセットの分化解析もおこなうことができます。1

サイトカインは典型的な分泌タンパクなので、BD GolgiStop™ (Monensin含有) あるいは BD GolgiPlug™ (Brefeldin A含有)といったような細胞内タンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。 その後、BD Cytofix/ Cytoperm™ fixation とpermeabilization solutionを用い緩やかな固定膜透過を行い測定します。 Brefeldin A は、小胞体に隣接するシス/中間ゴルジ嚢から小胞体へ産生したタンパクを戻す作用によりタンパク分泌を阻害します。Monensinは細胞膜側を向いているゴルジ体トランス面のNa++/H+ 輸送に作用することでタンパク分泌を阻害します。2 サイトカインの種類や動物種によって最適な細胞内タンパク輸送剤は変わります。表1参照.


動物種 サイトカイン 細胞内タンパク輸送阻害剤
ヒト IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α Monensin
ヒト IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-12, MCP-1,
MCP-3, MIG, MIP-1α, RANTES
Monensin あるいはBrefeldin A
マウス IL-6, IL-12, TNF-α Brefeldin A
マウス GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 Monensin
マウス IFN-γ, IL-2 Monensin あるいはBrefeldin A

CD8+ 細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

PBMCを刺激処理後、BD Cytofix/Cytoperm bufferを用い固定処理を行いサイトカイン産生の解析を行った。


CD8+細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

PBMCs を、BrefeldinA存在下でスタフィロコッカルエンテロトキシンB の刺激処理を 6時間行った。刺激後、細胞は BD Cytofix/Cytoperm bufferで固定処理を行った。細胞は、CD3 FITC, CD4 PerCP-Cy™5.5, CD8 Brilliant Violet 421, IFN-γ PE, そしてIL-2 APC抗体で染色を行った。細胞を洗浄しBD FACSVerse™ フローサイトメーターで測定を行った。

BDは、サイトカインと細胞表面マーカーの検出を簡単に行うためのキットやバッファー、豊富な抗体製品ラインをご提供しています。特に抗体に関しては、様々な条件、バッファーに対応する、細胞表面マーカーやサイトカインに対する蛍光標識抗体をご用意しております。また、BD Cytofix/Cytoperm bufferはサイトカイン産生能の解析においては、何千という文献で引用されている実績があります。


BD FastImmune™ キットの例

<構成品>

  • カクテル抗体
  • 細胞内タンパク輸送阻害剤
  • バッファー
  • 細胞調製プロトコール (その他、機器によってはテンプレートが予め入っています)Cytokine - BD FastImmune CD4 intracellular cytokine detection Kit


サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

刺激処理を行った全血のCD4 T細胞におけるIFN-γ 及びCD69発現の2色解析

 

サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

CD4 T細胞におけるIFN-γ 及びCD69発現の2色解析 無刺激(左パネル), SEB刺激 (中央パネルで陽性コントロール)及び CMV pp65刺激 (右パネル)。サンプルは異なるドナーから採取した2つの検体を用いた。ヒト全血を固定/膜透過/染色処理前に brefeldin A 存在下で刺激を行った。 なお染色は、BD FastImmune™ 3-color CD4 intracellular cytokine detection kitを用い、 BD FACSVerse フローサイトメーターで測定、BD FACSuite™ ソフトウェアで解析を行った。


1 Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8:247-258.

2 Schuerwegh AJ, Stevens WJ, Bridts CH, De Clerck LS. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factoralpha in monocytes. Cytometry. 2001;46:172-176.