細胞内フローサイトメトリー

     

細胞膜透過

エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する
エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

細胞膜透過処理は、細胞内でのエピトープの位置によって変化します。

フォスフォチロシン 701エピトープ (橙色) は、Stat二量体の内側にあり、フォスフォセリン727エピトープは、二量体の外側にあります。フォスフォチロシン 701は、膜透過性のより強いperm buffer IIIのようなバッファーが適切です。 リン酸化蛋白を誘導するために、ヒト末梢血単核細胞 (PBMCs)を 、ヒトIFN-α (Stat1 pY701)あるいはPMA (Stat1 pS727)で刺激処理を行い活性化した(+)。比較対象として、無刺激(–)サンプルをおいた。なお、リン酸化タンパク特異抗体で染色した後、BD Cytofix™ fixation bufferを使用して膜固定処理を行い 、BD Phosflow™ perm buffer I, II, III、あるいは IVを使用して膜透過処理を行った。


 
 

サイトカイン検出

CD8+細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生
CD8+細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

PBMCs を、BrefeldinA存在下でスタフィロコッカルエンテロトキシンB の刺激処理を 6時間行った。刺激後、細胞は BD Cytofix/Cytoperm bufferで固定処理を行った。細胞は、以下の抗体で染色を行った。CD3 FITC, CD4 PerCP-Cy™5.5, CD8 Brilliant Violet 421, IFN-γ PE, そしてIL-2 APC. 細胞を洗浄しBD FACSVerse™ flow cytometerで測定を行った。

サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生
サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

CD4 T細胞におけるIFN-γ 及びCD69発現の2色解析 無刺激(左パネル), SEB刺激 (中央パネルで陽性コントロール)及び CMV pp65刺激 (右パネル)。サンプルは異なるドナーから採取した2つの検体を用いた。ヒト全血を固定/膜透過/染色処理前に brefeldin A 存在下で刺激を行った。 なお染色は、BD FastImmune™ 3-color CD4 intracellular cytokine detection kitを用い、 BD FACSVerse フローサイトメーターで測定、BD FACSuite™ ソフトウェアで解析を行った。


 
 

転写因子

細胞内のフローサイトメトリーによるヒト Tregの解析
細胞内フローサイトメトリーによるヒト Tregの解析

ヒトPBMCを各々の表面マーカー特異抗体CD4 FITC, CD25 Brilliant Violet 421及び CD127 Alexa Fluor® 647 を用いて染色した。 洗浄後、細胞はBD Pharmingen transcription factor buffer setを用いて固定膜透過処理を行い、FoxP3 PE-CF594で細胞内マーカー染色し、BD FACSVerseフローサイトメーターで測定を行った。 Tregs (青色)は CD4+ CD25high CD127dim FoxP3+ でゲ-ティングを行った。

H9 hESCの内胚葉分化解析
H9 hESCの内胚葉分化解析

H9 ヒト胚性幹細胞(hESCs) (WiCell, Madison, WI) は、 D’Amour et al.1のプロトコールに従い3日間で 内胚葉へ分化させた。分化した細胞は BD Stemflow human definitive and pancreatic endoderm analysis kit及び CD184 PEを用いBD™ LSR II フローサイトメーターで測定した。. 分化した細胞では、多能性マーカーNanogの発現は減少し、 内胚葉マーカーSox17 (緑)とCD184の発現は増加した。


 

1 D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005; 23:1534-1541.

 

リン酸化タンパク

TregのIL-2刺激に対する感受性
TregのIL-2刺激に対する感受性

ヒトPBMCは、刺激後、ヒトCD127 Alexa Fluor® 647抗体で染色を行った。刺激は、ヒトリコンビナントIL-2を用い、濃度を変えて( 0-, 0.01-, 0.1-, 1-, 10-, 100-ng/mL)行った。 BD Cytofix fixation bufferで膜固定、BD Phosflow perm buffer IIIで膜透過処理を行い、Stat5 (pY694), CD4, CD8, CD25に対する蛍光標識抗体で染色した。検体はBD LSRFortessa™ フローサイトメーターを用いて測定し、 データはCytobank softwareで解析を行った。CD4 T細胞サブセットを示している。他のT細胞と比較してTregのリン酸化Stat5は低濃度IL-2領域で反応を示している。

ヒト白血球サブセットにおけるIL-4刺激に対するStat5 及びStat6シグナル伝達解析例
ヒト白血球サブセットにおけるIL-4刺激に対するStat5 及びStat6シグナル伝達解析例

ヒト全血を ヒトリコンビナントIL-4で刺激後、BD Phosflow human monocyte/NK cell activation kitを用いて固定膜透過処理及び染色を行った。検体は BD LSR II フローサイトメーターを用いて測定し、 データはCytobank softwareで解析を行った。データは、白血球サブセットを示す。IL-4刺激に対するStat6 (pY641)及びStat5 (pY694)のリン酸化解析では、TBMNKのすべてのサブセットにおいてStat6のリン酸化が見られたが、Stat5についてはNK細胞を除くTBM細胞サブセットでリン酸化が観察された。


 
 

多項目同時解析

IL-2 刺激を行ったT細胞サブセット解析例
IL-2 刺激を行ったT細胞サブセット解析例

ヒト全血を様々な濃度のヒトリコンビナントIL-2(0.05-100ng/mL)で15分間刺激した。 BD Phosflow™ lyse/fix bufferで膜固定、BD Phosflow perm buffer IIIで膜透過処理を行い, CD3, CD4, CD45RA, T-bet, Stat5 (pY694)に対する蛍光標識抗体で染色した。 検体は BD LSR II フローサイトメーターを用いて測定し、 データはCytobank softwareで解析を行った。

BALB/c マウスにおける胸腺及び脾臓のTh17 細胞解析
BALB/c マウスにおける胸腺及び脾臓のTh17 細胞解析

胸腺及び脾臓の細胞を、CD44、CD62L及びCD196の胞表面マーカー特異抗体あるいはアイソタイプコントロールで染色した。BD Pharmingen transcription factor buffer setで細胞を固定膜透過処理後、RORγt、Foxp3、IL-17A及びIFN-γの得意抗体で細胞内染色を行った。