細胞周期&増殖/アポトーシス

アポトーシス研究を合理的に行うためのツール

アポトーシスは、ある種のサイトカイン、タンパク間相互作用、および化学物質等で誘引されます。アポトーシスが開始されると、ミトコンドリアの膜電位変化が起こりますが、これは、BD™ MitoScreen (JC-1) フローサイトメトリーキットで測定が可能です。


ミトコンドリアの膜電位の上昇により、ミトコンドリア膜の透過性が高まり、Cytochrome CやPro-caspase等の可溶性タンパク質の放出を引き起こします。

Caspaseは、アポトーシスの最初の段階で、アスパラギン酸残基の位置で切断を受けて活性化する、一連のプロテアーゼです。活性型Caspaseはその後、Poly-ADP ribose polymerase(PARP) や他のCaspase等を含む多くのタンパクを切断することが出来ます。

DNAの断片化は、アポトーシスの最後段階の1つで、アポトーシス過程におけるエンドヌクレアーゼの活性化に起因しています。アガロースゲル電気泳動や末端標識等によって、DNA断片を単離・分離することを含むDNA断片化の研究のため、いくつかの確立された方法があります。

DNA断片化の測定では、BD™ APO-BrdU キットで使用されている末端標識法、あるいはterminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick end labeling (TUNEL法)を使います. このアッセイでは、TdTが、二本鎖および一本鎖DNAの3’ヒドロキシル(OH)末端へのbromolated deoxyuridine triphosphate(Br-dUTP)の鋳型非依存的付加を触媒します。二本鎖および一本鎖DNAへBr-dUTPが取り込まれた末端部位は、標識した抗BrdUで細胞を染色することによって、フローサイトメトリーで特定します。対照的にBrdU増殖アッセイは、新たに合成されたDNAや、DNA鎖切断部位にBrdUを取り込ませます。

                         
メカニズム アッセイ 主な特徴
細胞膜変化
(ホスファチジルセリンの露出)
Annexin 結合アッセイ
  • 標識を施した単品
  • Annexin V キット
  • 早期アポトーシスマーカーの検出
  • 迅速且つ簡単
  • フローサイトメトリーまたは免疫蛍光用
ミトコンドリアの変化 BD MitoScreen キット
  • 迅速且つ簡単、単一細胞で測定
  • フローサイトメトリーまたは免疫蛍光用
Caspaseの活性化 Caspase Activity Assay キット及び試薬
  • 迅速且つ簡単
  • 蛍光分光分析を使用
  Active Caspase-3 免疫測定 ELISA, フローサイトメトリーまたはウェスタンブロット
DNAの断片化
  • APO-BrdU TUNEL Assay
  • APO-DIRECT TUNEL Assay
  • 接着細胞で使用可能
  • フローサイトメトリーで単一細胞レベルでの解析可能
  • 細胞周期分析と組み合わせ可能

 

切断型Caspases及びPARPの測定

Caspasesは、アポトーシスの重要なイニシエーターです。 アポトーシスの最も早期に、かつ最も一貫して見られる特徴の1つは、細胞質プロテアーゼCaspaseの活性化です。アポトーシスが活性化されると、Caspaseは複数のタンパク基質を一斉に切断して、細胞の構造と機能を喪失させ、最終的に細胞死に至らしめます。特に、Caspase8、-9および-3はアポトーシスに関与し、Caspase9はミトコンドリア経路、Caspase8はFas/CD95経路、そしてCaspase3はより下流で働き、複数の経路によって活性化されます。

アポトーシス研究のためのツール

BD バイオサイエンスは、フローサイトメトリー、イメージング、ELISAなどで使用できる様々な抗体から、個々の蛍光発生ペプチド基質や阻害剤、キット、すぐに使えるアッセイプレートまで、Caspase活性の測定における幅広いツールを提供いたします。

Caspase-3の切断/阻害反応
Caspase-3の切断/阻害反応

活性型Caspase-3は蛍光発生基質Ac-DEVD-AMCに結合し、アスパルギン酸(D)とAMCの間を切断し、蛍光性のAMCを遊離します。AMCの蛍光はUV分光蛍光分析によって定量します。Ac-DEVD-CHOアルデヒド阻害剤は、Caspase-3活性部位に強固に結合し、基質の結合を遮断します。従って、Ac-DEVD-AMCは切断されず、蛍光は発生しません。

抗 活性型Caspase-3抗体を用いた、アポトーシスを起こしている細胞と起こしていない細胞集団のフローサイトメトリー分析
抗 活性型Caspase-3抗体を用いた、アポトーシスを起こしている細胞と起こしていない細胞集団のフローサイトメトリー分析

Jurkat T細胞(A、A1)またはマウス胸腺細胞(B、B1)は、無処理のまま(A、B)、あるいはカンプトテシン(A1)またはアポトーシスを誘導するマウスFasモノクローナル抗体クローンJo2(Cat. No. 554254)(B1)で4時間処理した。膜透過した後、PEと接合した活性型Caspase3抗体(Cat. No. 557091)で染色した。無処理の細胞は基本的に活性型Caspase-3陰性であったが、アポトーシス誘導処理をしたそれぞれの細胞集団の約半分が活性型Caspase-3陽性であった。