T-Cell Research

T細胞研究のための様々なツール

免疫系は、無数の病原微生物や外来抗原を異物として認識し排除します。なかでも、獲得免疫系は、遺伝子再構成の産物である多種多彩な抗体やT細胞受容体による特異的な免疫応答により生体を防御しています。T細胞による免疫応答は、感染症や自己免疫疾患を研究する上で、重要な反応であり、その動態は細胞表面マーカーの表現型やサイトカインプロファイルを通して同定することができます。

BD バイオサイエンスは、最先端のテクノロジーと製品を統合した包括的なアプローチにより、T細胞サブセットTh1, Th2, Th9, Th17, Tfh, NKT, そして制御性T細胞の研究に貢献します。

概要 ヘルパーT細胞 制御性T細胞

骨髄の造血幹細胞に由来する、T前駆細胞は胸腺での選択を経て様々な機能を有するT細胞へと分化成熟します。

分化の過程で、幼若なT前駆細胞は、 生存維持や分化に関わる様々な因子による制御をうけ、T細胞系列へと決定づけられます。特に、TCR, CD3, CD4, そしてCD8といったマーカーは恒常的に発現し成熟なT細胞としての機能を発揮します。 細胞表面マーカー、転写因子、細胞内シグナル伝達分子などの様々な解析を行うことで、成熟したT細胞に至るまでの各ステージへの誘導、維持に働く分子機構を知ることができます。


免疫系は、宿主と病原微生物の生存をかけた攻防の果てに進化した、多種多彩なメカニズムが集積する複雑な制御機構です。これらの研究のためには、様々なアプリケーションが必要とされていますが、フローサイトメトリーによるマルチカラー解析では幅広い解析を行うことができます。蛍光標識抗体を用いた基本的な解析では、個々の細胞における標的分子の発現レベルを多様な分化ステージで確認することができます。 さらに、BD™ CBA(定量的測定試薬) やBD™ Phosflow(シグナル伝達解析試薬) では、細胞の様々なイベントや分子機構を解析することができます。

また、ELISAやELISPOT、In Vivoでのサイトカイン産生測定など従来の手法にも対応しています。

BD バイオサイエンスは、革新的なFACS™ システムと高品質 BD Pharmingen™ ブランドを通して皆様の研究を支援しています。

多彩な免疫反応を調節するヘルパーT細胞

獲得免疫は、外来抗原への暴露後、後天的に形成され、高度な特異性と免疫記憶を特徴としています。なかでも、T細胞は獲得免疫の中枢司令塔であり、各々のサブセットが特徴的な機能を持つことが知られています。ヘルパーT細胞は、認識した抗原に応じて、異なる細胞集団を誘導あるいは活性化し免疫反応を調節します。

樹状細胞の抗原提示細胞(APC)による刺激を受けると、ナイーブT細胞は活性化し取り巻くサイトカイン環境により分化誘導され、特定のサイトカインを産生するeffector T細胞としての機能を発揮します。


抗原提示細胞により抗原が提示されると、抗原に対して親和性の高いTCRを保有するT細胞に、TCR刺激を起点とした細胞内シグナルが伝達されます。それと同時に、共刺激因子を介した抗原非特異的な刺激やサイトカインによるシグナルを受け取ります。特定のサイトカイン環境下で抗原刺激を受けたナイーブT細胞は、増殖、分化、サイトカイン産生などのT細胞としての運命が決定され、各サブセットへ分化します。Th1, Th2, Th9, Th17や Tfh細胞などへ分化した細胞はサイトカインを分泌し、NK細胞やB細胞などへ攻撃命令をだす、マクロファージの食作用を促すなど、種々のリンパ球のもつ機能を活性化し誘導します。一部長期生存するメモリーT細胞は、再び抗原にさらされると迅速かつ効率よく誘導されその機能を発揮します。

マルチカラー解析は、こうした多彩な細胞集団の性質をとらえることに最適な手法です。ヘルパーT細胞のような細胞集団は、 各サブセットを特徴づける細胞表面マーカーと、サイトカインや転写因子をはじめとする細胞内マーカーを組み合わせることで、簡単かつ迅速に複数の影響因子を解析できます。また、複数のサイトカインを同時に定量できるBD™ CBAによる解析などを並行して行うことでより深い知見を得ることができます。


ヘルパーT 細胞製品についてはこちら »


Th1 細胞

Th1細胞は、細胞性免疫を司り細胞内寄生細菌やウィルスに対する感染防御を行います。Th1細胞によりIFN-γやIL-2、LTαなどの炎症性サイトカインが放出されると、マクロファージや細胞障害性T細胞は活性化し、効率よく貪食する、病原微生物を破壊する、標的となる細胞を認識し殺傷するなどその役割を果たします。また、多発性硬化症やインスリン依存性糖尿病といった慢性炎症疾患は、Th1の関与が示唆されています。

Th2細胞

Th2細胞は、 液性免疫を司り、細胞外寄生性病原体に対してアレルギー反応といったような生体防御を行います。Th2細胞のIL-4, IL-5, IL-6, IL-10やIL-13といったサイトカイン分泌をうけると、IL-4により形質細胞は抗原特異的な抗体産生を促され、抗体は病原微生物を捉える、IL-5 によって分化増殖した好酸球は顆粒タンパクの放出により寄生虫を傷害するなど、種々の細胞はその機能を発揮します。また、Th2細胞は、IL-9の供給源であると考えられてきましたが、近年IL-9とIL-10を分泌するTh9細胞が報告されています。Th9細胞は、TGF-β存在下でTh2細胞から分化、あるいは、IL-4及びTGF-β存在下でナイーブT細胞から分化し、喘息や組織の炎症に関与すると考えられています。


Th17 細胞

Th17 細胞

IL-17を産生するTh17 細胞は、アレルギーや自己免疫、細胞外増殖性の細菌感染防御で中心的な役割を果たします。マスター転写因子RORγtを発現し、naive CD4T細胞からIL-6とTGF-β により分化誘導されます。

Th17細胞は、TGF-βや IL-21によって増殖、主にIL-23 (p19/p40)によって維持され、IL-23 は IL-23受容体と結合し下流のSTAT3を活性化 、結果ROR-γの発現やIL-17Aの発現を促します.産生されたIL-17Aは、 マクロファージや繊維芽細胞など種々の細胞に作用し、TNFやIL-6などの様々な炎症性メディエータを誘導します。

一方でTregは、TGF-βにより誘導されるため、IL-6とTGF-βの相対的なバランスがTh17とTregの分化バランスを調節していると考えられ、免疫学的恒常性の維持、自己免疫疾患のメカニズムを理解するうえで重要とされています。

免疫反応に対する抑制的制御 制御性T細胞

免疫系は、外来抗原を認識し排除すると同時に、自己に対する異常あるいは過剰な免疫応答を抑制する負の制御機構を備えています。なかでも、制御性T細胞(Tregs)による免疫反応の抑制的制御は、免疫自己寛容や生体の恒常性維持において重要な役割を担っています。Tregの主要転写因子FoxP3は同定および特性分析に一般的に用いられるマーカーですが、Tregは非常に活発な研究分野であり、CTLA-4, C45RA, C39、CD127など、新しいマーカーが文献に発表されています。 BDは、これらの発見をサポートするために、新しいポートフォリオを常に開拓し続けます。

制御性T細胞についてより詳しく »

概要 表現型解析 細胞内サイトカイン 細胞内シグナル伝達 分泌サイトカイン

BDは、最先端のテクノロジーと製品を統合した包括的なアプローチにより、T細胞研究に貢献します。

免疫系は、宿主と病原微生物の生存をかけた攻防の果てに進化した、多種多彩なメカニズムが集積する複雑な制御機構です。これらの研究では様々なアプリケーションが必要とされていますが、フローサイトメトリーでは、その表現型を多様な分化ステージで確認することができ、さらに、BD™ CBA(定量的測定試薬) やBD™ Phosflow(シグナル伝達解析試薬) では、細胞の様々なイベントや分子機構を解析することができます。また、ELISAやELISPOTなどの従来の手法を合わせて用いることでT細胞研究のさらなる深い知見を得ることができます。


T細胞研究における手法比較

下表は、T細胞研究に使われる手法を紹介しています。様々な手法を組み合わせて用いることで、より深い知見を得ることができます。BDはこれらの免疫研究に必要な試薬ポートフォリオを常に拡大しています。

テクノロジー 細胞表面 細胞内 BD™ CBA ELISPOT ELISA In Vivo Capture Assay
検出分子 細胞表面 細胞表面/細胞内 分泌あるいは細胞内 分泌 (in situ) 分泌 分泌 (in vivo)
マルチパラメーター × × × ×
シングルセル/サブセット
information
× 頻度、サブセット情報無し × ×
抗原特異性
アッセイ後生存率 × ○(分泌タンパク) ×
タンパク定量 可能* 可能* ×
使用機器 フローサイトメーター フローサイトメーター フローサイトメーター ELISPOT リーダー 分光光度計 分光光度計

*スタンダートとともに測定 (例 BD Quantibrite™ビーズ)

表現型フェノタイピング: 各細胞集団に特異的なタンパク発現解析に最適です。

細胞集団は、 各サブセットを特徴づける細胞表面マーカーと細胞内マーカーを組み合わせることで表現型を同定することができます。例えば、細胞表面マーカーとシグナル伝達タンパクの同時解析は、シグナル伝達反応の特徴を捉えることができます。

細胞内サイトカイン

免疫反応の一つ、活性化細胞によるサイトカインのような炎症性メディエーターの分泌は簡単に解析することができます。細胞内フローサイトメトリーは、ヘテロな細胞集団の分泌物質を個々に測定することができます。BD Cytofix/Cytoperm™ などのキットを使えばより簡単です。

細胞内シグナル伝達

細胞表面マーカーと組み合わせて解析を行えるため、ウェスタンブロットのようなライセートを用いる手法と異なりヘテロな細胞集団でのシグナル伝達反応を測定することができます。 BD Phosflow™は、リン酸化タンパク解析のための専用試薬です。

可溶性タンパク

ELISAやBD™ CBAのような手法は、細胞集団全体の分泌物質を定量解析する手法です。特にCBAは多項目のタンパクを同時に定量解析できるためT細胞研究に必須です。その他、ELISPOT はサイトカイン産生細胞の頻度をex vivoで測定できます。 また、 BD™ In Vivo Capture Assayではin vivoのサイトカイン直接とらえて定量します。

フローサイトメトリーは表現型・機能解析に不可欠なツールです。


ヒト全血におけるT細胞サブセット解析

T細胞サブセット解析とそのマーカー

分化の過程で、幼若なT前駆細胞は、 生存維持や分化に関わる様々な因子による制御をうけ、T細胞系列へと決定づけられます。T細胞サブセットは、CD4やCD8などの各マーカーの発現により同定することができます。 蛍光標識抗体を用いた基本的な解析では、個々の細胞における標的分子の発現レベルを多様な分化ステージを確認することができます。 また、CCR7, CD62Lや CD69といったようなマーカーも合わせて ることで、活性化の状態や局在を解析することもできます。

さらには、サイトカインやシグナル伝達分子などにより、細胞の様々なイベントや分子機構を解析することで、Th1, Th2, Th17, Treg, Th9各T細胞サブセットの異なる機能を解析することができます。

主なT細胞マーカーはこちら »

特定の細胞集団を選択し分取する

セルソーターを使用すると細胞を分取できるため、生細胞を増殖、分化誘導などの培養実験に用いることができます。

BDは、高い細胞収率を得るための詳細なプロトコールや抗体パネルといった学術的な情報を提供しています。

マルチカラー解析はこんなに簡単 多項目同時解析のための便利ツール

マルチカラー解析を行う際に、しばしばハードルになるのは、抗体パネルのデザインと蛍光補正、機器設定です。BDは、これらを簡単にする抗体や蛍光補正試薬、抗体パネル作成ツール、学術的内容も含め提供しています。

マルチカラー解析のための便利ツール»

主要なT細胞マーカー

細胞のタイプ 細胞障害性 Th1 Th2 Th9 1 Th17 Tfh 2 Treg
主な機能 ウィルス感染細胞の殺傷 感染マクロファージの
殺菌機能活性化、
およびB細胞の抗体産生補助
B細胞の活性化、分化、
クラススイッチを促進
T 細胞増殖、
B細胞によるIgG及びIgE産生を誘導
好中球応答の促進
抗原特異的B細胞の分化
及び抗体産生の制御
免疫応答の抑制的制御
病原微生物 及び外来抗原

ウィルス及び 細胞内細菌

細胞内病原体 寄生虫 寄生虫 真菌及び細胞外細菌 - -
病態形成 移植拒絶 自己免疫疾患 アレルギー、喘息 アレルギー 臓器特異的自己免疫疾患
disease
自己免疫疾患 自己免疫疾患,
腫瘍
細胞外マーカー CD8 CD4, CXCR3 CD4, CCR4, Crth2 (ヒト) CD4 CD4, CCR6 CD4, CXCR5 CD4, CD25
分化に必要なサイトカイン - IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, IL-27 IL-4, IL-2, IL-33 IL-4, TGF-β TGF-β, IL-6, IL-1, IL-21, IL-23 IL-12, IL-6 TGF-β, IL-12
エフェクターサイトカイン IFN-γ, TNF, LT-α IFN-γ, LT-α, TNF IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 IL-9, IL-10 IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22,
IL-26, TNF, CCL20
IL-21 TGF-β, IL-10
転写因子 - T-bet, Stat1, Stat6 GATA3, Stat5, Stat6 GATA3, Smads, Stat6 RORγt, RORα, Stat3 Bcl-6, MAF FoxP3, Smad3, Stat5

細胞を取り巻く環境、分化ステージなどの要因で発現する分子は影響をうけます。主要なサイトカインは 太字で示されています。 BD バイオサイエンスでは、特に 赤字で示されている試薬を提供しています。

  1. Soroosh P, Doherty TA. Th9 and allergic disease. Immunology. 2009;127:450-458.
  2. Fazilleau N, Mark L, McHeyzer-Williams LJ, McHeyzer-Williams MG. Follicular helper T cells: lineage and location. Immunity. 2009;30:324-335.

T細胞による特異的な免疫応答とサイトカインの検出

細胞内フローサイトメトリーは、ヘテロな細胞集団の分泌物質を複数同時に測定することができます。サイトカイン環境によってその役割を変え自らもサイトカインを分泌してその機能の一部を発揮するT細胞サブセットの研究においては必須の技術です。

細胞内サイトカインの検出

細胞内フローサイトメトリーによる、活性化細胞におけるサイトカイン産生能の解析は、非常に簡単で、標準的な手法が確立されています。サイトカインは典型的な分泌タンパクなので、細胞内タンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。 その後、BD Cytofix/ Cytoperm™ fixation とpermeabilization solutionを用い緩やかな固定膜透過を行い測定します。

BDは、サイトカインと細胞表面マーカーの検出を簡単に行うためのキットやバッファー、豊富な抗体製品ラインをご提供しています。特に抗体に関しては、様々な条件、バッファーに対応する、細胞表面マーカーやサイトカインに対する蛍光標識抗体をご用意しております。

BD Cytofix/Cytoperm を用いた手法

The BD Cytofix/Cytoperm固定膜透過用バッファーはサイトカイン産生能の解析においては、数多くの文献で引用されている実績があります。様々な動物種、サイトカイン、細胞表面マーカーに対応する標準的な手法です。

BD Cytofix/Cytopermについてさらに詳しく »

BD Phosflow™によるヘテロな細胞集団におけるシグナル伝達解析

T細胞の活性化といったように、細胞が活性化せよといった命令に応答する際には、細胞膜の受容体は分子を受け取り、それを契機として次々に下流へシグナルを変換し伝え、最終的に転写因子による転写制御をうけイベントが発生するという流れをたどります。シグナルを伝える分子スイッチは、主にリン酸化によって切替わる分子が役割を担っていることが多く、ナイーブCD4<sup>+</sup> T 細胞から各サブセット Th1, Th2, Th9, Th17, Tfh, Tregへの分化はリン酸化カスケード反応により開始します。

リン酸化による活性化のカスケード反応を捉えるBD Phosflowテクノロジー

BD Phosflowではフローサイトメトリーによるリン酸化解析を行えます。細胞表面マーカーと組み合わせて解析を行えるため、ウェスタンブロットのようなライセートを用いる手法と異なりヘテロな細胞集団でのシグナル伝達反応を測定することができます。 このため、事前濃縮をせずにレアポピュレーションの解析をおこなうこともできます。

最適な組み合わせの抗体とバッファー、そしてプロトコール

BD Phosflow™ 製品は、膜固定・透過処理剤と蛍光標識抗体の組合せについての検証を研究者とともにおこなっており、最適化されています。

検証された条件や緩衝系、染色プロトコルは本ウェブサイトに情報を蓄積しています。また、使い易いReady to useのキット製品もご提供しています。 B細胞、T細胞、単球、NK細胞をヒト全血から解析する、Human monocyte/NK cell activation キット(Cat. No. 562089)とCD4 T細胞CD8T細胞解析用のHuman T-cell activation キット (Cat. No. 560750)をご用意しています。

BD Phosflowについてさらに詳しく»

Transcription Factor Buffer Set

TF Buffer setは転写因子サイトカイン同時解析用バッファーで、細胞を適切に固定・膜透過処理することができ様々な核内エピトープを測定することができます。

徴的な緩衝液系を必要とする転写因子FoxP3を始めとし様々な転写因子とサイトカインに対応しています。

特徴
  • フローサイトメーターによる細胞質内及び核内のタンパク検出に最適化されたバッファー
  • FoxP3, RORγt, T-bet を始めとする様々な転写因子検出の改善
  • 検体処理が簡便・迅速
  • 様々な細胞やタンデム蛍光色素に対応
  • ハイスループット解析を容易に行えるよう、バッファー類を減らすことができ、細胞は大容量で固定、保存可能。

TFBuffer についてさらに詳しく »

分泌サイトカインの定量解析を、一度に多項目行うことができます。

ELISAやBD™ CBAのような手法は、細胞集団全体の分泌物質を定量解析する手法です。特にCBAは多項目のタンパクを同時に定量解析できるためT細胞研究に必須です。その他、ELISPOT はサイトカイン産生細胞の頻度をex vivoで測定できます。 また、 BD™ In Vivo Capture Assayではin vivoのサイトカイン直接とらえて定量します。

BD CBA 多項目タンパク定量

BD CBA はフローサイトメーターで1サンプルから多種類のタンパクを、同時に定量解析できます。サイトカインやケモカイン、成長因子、免疫グロブリンなどを、血清、血漿、細胞培養液などから検出できます。免疫反応をモニタリングするための様々な因子を同時測定できます。

BD CBAについてさらに詳しく »

BD ELISA タンパク定量

ELISAは1種類のサイトカインを定量するもっとも古典的な手法です。BDは、Ready to Useの便利なキットを、最適なペア抗体とスタンダード、プロトコールを1つのパッケージにしています。(単品もご用意しています)

BD ELISAについてさらに詳しく »

BD ELISPOT 単一細胞レベルのサイトカイン検出

BD ELISPOTアッセイは、in vitroで、単一細胞レベルで分泌サイトカインを検出でき、さらに用いたサンプルはクローニングや増殖アッセイなどに使用できます。T細胞の特異的な免疫応答、特定の抗原に対して免疫応答し活性化しサイトカイン産生を開始する細胞をとらえます。対象物質にもよりますが、ELISAよりも数十倍感度が高く、RT-PCRと同じような感度を示します。

BD ELISPOTについてさらに詳しく»

BD in vivo captureアッセイ in vivoのサイトカイン産生検出

BD In Vivo Captureアッセイは、in vivo(マウス)でのサイトカイン産生を直接測定します。通常生体内のサイトカインは半減期が短いため、サイトカイン特異抗体を注射し複合体を形成させることで血中に蓄積させます。その後、マウスの血清をELISAで測定し定量を行います。これらの試薬はすべてキットになっています。

In Vivo Capture サイトカインアッセイについてさらに詳しく »

サイトカイン測定法の比較

可能な解析 BD CBA ELISA ICS
一度に複数サイトカイン同時検出
サイトカイン発現細胞の表現型解析
分泌サイトカイン定量

様々な細胞サブセット

Th細胞サブセット極在条件下での細胞内サイトカイン解析

CD4+ and CD8+ T 細胞における3種のサイトカイン同時解析

naïve, memory及びeffector T 細胞 (part A)のサイトカイン発現解析

naïve, memory及びeffector T 細胞 (part B)のサイトカイン発現解析

抗原特異的CD4+ IFN-γ 反応

BD Pharmingen Transcription Factor Buffer Setを用いて異なる細胞調整を行ったフローサイトメトリーによる転写因子解析( Cat#562574)

Th17

細胞内サイトカイン解析(ヒトPBMC)

Human Th1/Th2/Th17 Phenotyping Kitを用いたTh17細胞解析

IL-17AおよびIL-17F解析

Th17細胞の細胞内解析(時系列)

Th17細胞培養の多項目サイトカイン定量解析

Th17細胞極性下のBALB/CマウスにおけるRORgt及びIL-17Aの発現

サイトカイン,転写因子, 細胞表面マーカーの同時検出による マウスTh17 細胞解析

リソース ツール

アプリケーションノート

製品冊子

FAQ

製品Information Sheet

製品リスト

プロトコール

学術オンライントレーニング


For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.

Alexa Fluor® is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

Cy™ is a trademark of Amersham Biosciences Corp. Cy dyes are subject to proprietary rights of Amersham Biosciences Corp and Carnegie Mellon University and are made and sold under license from Amersham Biosciences Corp only for research and in vitro diagnostic use. Any other use requires a commercial sublicense from Amersham Biosciences Corp, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ 08855-1327, USA.

Ficoll-Paque is a trademark of GE Healthcare.