Intracellular Flow

フローサイトメトリーによる、サイトカイン, 転写因子, リン酸化タンパクの多項目解析

単一細胞レベルで、複数タンパクを同時に検出するには、フローサイトメトリーの技術は必須です。 Th17や制御性T細胞(Treg)のような細胞集団は、 各サブセットを特徴づける細胞表面マーカーと、サイトカインや転写因子をはじめとする細胞内マーカーを組み合わせることで表現型を同定することができます。

細胞内のフローサイトメトリーにより、様々な細胞の機能やシグナル伝達の情報が一度に得ることができます。蛍光標識抗体細胞表面マーカー特異的にアポトーシス,細胞増殖, タンパクのリン酸化マーカーを組み合わせることで、様々な刺激や細胞処理に反応する細胞サブセットを決定づけることができます。複数のマーカーを組み合わせ一度に解析を行うことで、 データ収集時間が短縮され、貴重なサンプルを節約できます。

細胞膜透過 サイトカイン 転写因子 リン酸化タンパク 多項目同時解析

マルチカラー解析は、各細胞集団に特異的なタンパク発現解析に最適です。

Th17のような細胞集団は、 各サブセットを特徴づける細胞表面マーカーと細胞内マーカーを組み合わせることで表現型を同定することができます。例えば、細胞表面マーカーとシグナル伝達タンパクの同時解析は、シグナル伝達反応の特徴を捉えることができます。


細胞表面染色は標準的な手法が確立されている一方で、細胞内染色は、タンパクの生物学的な特徴に左右されます。 したがって、細胞内での位置、他の分子との関係、安定性の違いによって、推奨される細胞調製や染色法が異なります。

例えば、サイトカインは典型的な分泌タンパクですが、BD GolgiStop™ (Monensin含有) あるいは BD GolgiPlug™ (Brefeldin A含有)といったようなタンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。その後、BD Cytofix/ Cytoperm™ fixation とpermeabilization solutionを用い緩やかな固定膜透過を行う簡単で標準的な手法で測定します。

サイトカインとは対照的に、転写因子は核内に局在していたりDNA等と結合していることがあります。また、Stat5のようにリン酸化を受けているタンパクは、ダイマーを形成しリン酸化エピトープ部位がマスクされていることもあります。 さらには、 フォスファターゼは他のタンパクを脱リン酸化し次々にシグナルを伝えるため、刺激処理をした細胞はすぐに固定する必要があります。目的とするエピトープへ抗体が適切にアクセスできるよう比較的強い膜透過処理を行います。

細胞内染色の基本的な原理

細胞内染色の基本的な原理

複数の細胞内タンパクを検出するには異なる条件が必要とされる場合もありますが、基本的な原理は同じです。すなわち、細胞は、固定・膜透過処理 (破線が膜を表しています。)を行い, 蛍光標識抗体で染色しフローサイトメトリーにより解析を行います。 分泌タンパクの測定では、タンパク分泌阻害剤で初めに処理をし細胞内に目的のタンパクを貯留します。

BD が提供する細胞内フローサイトメトリーの ツール

単一細胞レベルで、複数タンパクを同時に検出するには、フローサイトメトリーの技術は必須です。 BD は様々なキット、バッファー、プロトコールを提供しています。また、蛍光標識抗体を様々なバッファーや条件でテストしているため、研究に従事する時間やコストを削減することができます。

サイトカインの検出
BD Cytofix/Cytoperm fixation/permeabilization solution (Cat. No. 554722)は、様々なサイトカインを染色することに適しています。ホルムアルデヒドを用いたマイルドな固定を行いますので、いくつかの転写因子や細胞内タンパクと合わせて測定することもできます。

転写因子
BD Pharmingen™ transcription factor buffer set (Cat. No. 562574/562725) は、細胞表面マーカーと、様々な転写因子、サイトカインを複数組み合わせ測定することができます。ホルムアルデヒドを用いたマイルドな固定を行います。

リン酸化タンパクの検出
BD Phosflow™ perm buffer III (Cat. No. 558050)はフローサイトメトリーによる、リン酸化エピトープの検出に最適な膜透過剤です。 Perm buffer IIIは、アルコールを含むバッファーです。 また、実験系によってはPermeabilization bufferを代わりに使うことが できます。


Cell Perm - STAT phosphotyrosine epitopes

活性化した細胞において 、ダイマライゼーションすることでSTAT リン酸化チロシンエピトープはマスクされている。


エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

細胞膜透過処理は、細胞内でのエピトープの位置によって変化します。

フォスフォチロシン 701エピトープ (橙色) は、Stat二量体の内側にあり、フォスフォセリン727エピトープは、二量体の外側にあります。フォスフォチロシン 701は、膜透過性のより強いperm buffer IIIのようなバッファーが適切です。 リン酸化蛋白を誘導するために、ヒト末梢血単核細胞 (PBMCs)を 、ヒトIFN-α (Stat1 pY701)あるいはPMA (Stat1 pS727)で刺激処理を行い活性化した(+)。比較対象として、無刺激(–)サンプルをおいた。なお、リン酸化タンパク特異抗体で染色した後、BD Cytofix™ fixation bufferを使用して膜固定処理を行い 、BD Phosflow™ perm buffer I, II, III、あるいは IVを使用して膜透過処理を行った。

免疫反応の一つ、活性化細胞によるサイトカインのような炎症性メディエーターの分泌は簡単に解析することができます。

ELISAやBD™ CBAのような手法は、細胞集団全体の分泌物質を測定する手法です。対照的に、細胞内フローサイトメトリーは、ヘテロな細胞集団の分泌物質を個々に測定することができます。.


細胞内フローサイトメトリーによる、活性化細胞におけるサイトカイン産生能の解析は、非常に簡単で、標準的な手法が確立されています。これは、貴重な細胞集団がサイトカインを多量に産生している場合でも、細胞数の多い細胞集団がサイトカインを少量産生している場合でも同様です。さらには、転写因子などとも同時に測定することも可能ですので、各細胞サブセットの分化解析もおこなうことができます。1

サイトカインは典型的な分泌タンパクなので、BD GolgiStop™ (Monensin含有) あるいは BD GolgiPlug™ (Brefeldin A含有)といったような細胞内タンパク輸送阻害剤を使用して細胞内に貯留させます。 その後、BD Cytofix/ Cytoperm™ fixation とpermeabilization solutionを用い緩やかな固定膜透過を行い測定します。 Brefeldin A は、小胞体に隣接するシス/中間ゴルジ嚢から小胞体へ産生したタンパクを戻す作用によりタンパク分泌を阻害します。Monensinは細胞膜側を向いているゴルジ体トランス面のNa++/H+ 輸送に作用することでタンパク分泌を阻害します。2 サイトカインの種類や動物種によって最適な細胞内タンパク輸送剤は変わります。表1参照.


動物種 サイトカイン 細胞内タンパク輸送阻害剤
ヒト IL-1α, IL-6, IL-8, TNF-α Monensin
ヒト IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-12, MCP-1,
MCP-3, MIG, MIP-1α, RANTES
Monensin あるいはBrefeldin A
マウス IL-6, IL-12, TNF-α Brefeldin A
マウス GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 Monensin
マウス IFN-γ, IL-2 Monensin あるいはBrefeldin A

CD8+細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

CD8 + 細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

PBMCを刺激処理後、BD Cytofix/Cytoperm bufferを用い固定処理を行いサイトカイン産生の解析を行った。


BDは、サイトカインと細胞表面マーカーの検出を簡単に行うためのキットやバッファー、豊富な抗体製品ラインをご提供しています。特に抗体に関しては、様々な条件、バッファーに対応する、細胞表面マーカーやサイトカインに対する蛍光標識抗体をご用意しております。また、BD Cytofix/Cytoperm bufferはサイトカイン産生能の解析においては、何千という文献で引用されている実績があります。


BD FastImmune™ キットの例

<構成品>

  • カクテル抗体
  • 細胞内タンパク輸送阻害剤
  • バッファー
  • 細胞調製プロトコール (その他、機器によってはテンプレートが予め入っています)
Cytokine - BD FastImmune CD4 intracellular cytokine detection Kit

サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4 +CD69 +T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

刺激処理を行った全血のCD4 T細胞におけるIFN-γ 及びCD69発現の2色解析


1 Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8:247-258.

2 Schuerwegh AJ, Stevens WJ, Bridts CH, De Clerck LS. Evaluation of monensin and brefeldin A for flow cytometric determination of interleukin-1 beta, interleukin-6, and tumor necrosis factoralpha in monocytes. Cytometry. 2001;46:172-176.

フローサイトメトリーでは、ヘテロな細胞集団における転写因子解析が可能です。

単一細胞レベルでの、複数タンパク同時解析により、時系列変化や分化段階の特徴を捉えることができます。様々なマーカーの相対的な発現レベルの情報とともに特定の細胞集団の絶対数なども得ることができます。


細胞内サイトカイン染色と同様に、転写因子の検出には固定と膜透過処理を行います。 転写因子は核内に位置していたりやDNA等に結合していることがあるため、一般的にはエピトープによって推奨される細胞調製や染色法が異なります。

BDのTranscription Factor Buffer Setは、様々な転写因子やサイトカインの同時解析に最適なバッファーです。細胞質内及び核内のタンパク検出に最適化されているため、 他の転写因子には適応することが難しい緩衝系を必要とする転写因子FoxP3にも対応しています。転写因子、多くの細胞表面マーカー及びサイトカインにも使用することができます。


ヒト制御性T細胞における細胞内マーカー解析

ヒト制御性T細胞における細胞内マーカー解析

Transcription factor buffer setを用いたCD4 FITC, CD25 Brilliant Violet 421, 及び CD127 Alexa Fluor® 647,FoxP3 PE-CF594によるヒト制御性T細胞解析

幹細胞研究に最適なキット

BD Stemflow™ シリーズ は、heterogeneous な幹細胞における、多分化能や分化状態の特性をフローサイトメーターによって解析するためのキットです。
高い再現性と実験効率を得るために、試薬・検証されたプロトコール及び解析ツールをまとめたReady-to-use キットにしました。幹細胞の主要な細胞表面マーカーや多能性の維持に関与する転写因子を検出でき、さらには、特定の抗体を追加して、研究目的に柔軟に対応できる構成になっています。
キットには、Ready-to-use の抗体に加え細胞調製試薬、各々の解析に必要に応じて補正ビーズ・標準プロトコール及び解析ガイドラインなどが含まれています。

  • ヒト及びマウス多能性幹細胞転写因子解析キット(Cat. No. 560589. 560585)
  • ヒト神経系細胞解析キット (Cat. No. 561526)
  • ヒト内胚葉分化解析キット(Cat. No. 562496))


H9 ヒト胚性幹細胞による内胚葉分化解析

H9 ヒト胚性幹細胞による内胚葉分化解析

BD Stemflow human definitive and pancreatic endoderm analysis kit及び CD184 PEを用いた内胚葉分化解析。H9 ヒト胚性幹細胞(hESC)からプロトコールに従って分化させた細胞を用いた。


1 Birzele F, Fauti T, Stahl H, et al. Next-generation insights into regulatory T cells: expression profiling and FoxP3 occupancy in Human. Nucleic Acids Res. 2011;39:7946-7960.

2 Beyer M, Thabet Y, Müller RU, et al. Repression of the genome organizer SATB1 in regulatory T cells is required for suppressive function and inhibition of effector differentiation. Nat Immunol. 2011;12:898-907.

3 Wang P, McKnight KD, Wong DJ, et al. A molecular signature for purified definitive endoderm guides differentiation and isolation of endoderm from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 2012;2:2273-2287.

4 Takayama K, Inamura M, Kawabata K, et al. Efficient and directive generation of two distinct endoderm lineages from human ESCs and iPSCs by differentiation stage-specific SOX17 transduction. PLoS One. 2011;6:e21780.

5 Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 2008;132:661-680.

6 D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005; 23:1534-1541.

フローサイトメトリーで、ヘテロジニアスな細胞集団の様々なシグナル伝達解析が可能です。

細胞表面マーカーと組み合わせて解析を行えるため、ウェスタンブロットのようなライセートを用いる手法と異なりヘテロな細胞集団でのシグナル伝達反応を測定することができます。 このため、小規模な細胞集団の中の強力なリン酸化反応なのか、それよりは大きな集団の中での微弱なリン酸化反応なのか区別することができます。

また、全血のような複雑な細胞混合物が含まれるサンプルにも対応しています。

さらには、レアポピュレーションや事前濃縮していない細胞集団も解析できるため、貴重なサンプルを有効活用でき、実験に従事する時間を短縮、コストを抑えることができます。


BD Phosflow™ 製品は、膜固定・透過処理剤と蛍光標識抗体の組合せについての検証をおこなっており、最適化されています。

特異的なリン酸化エピトープを検出するには、タンパクのリン酸化状態を維持するよう固定し、細胞内で抗体が標的タンパクと結合するよう膜透過処理を行います。タンパクのリン酸化は、本来一過性のものであり、フォスファターゼによって強く制御されています。したがって、適切なタイムポイントでの刺激と、フォスファターゼの迅速な不活化が必要であり、フローサイトメトリー解析ではリン酸化エピトープを維持するために迅速に固定を行います。 もう一つ重要なのは、リン酸化タンパクの発現量です。特に、発現量が低く単一細胞レベルで検出することが難しい場合、あるいは、目的とする部位が不完全なリン酸化を示す場合などは困難な場合があります。このため、BDでは、高品質であるとともに、感度を上げる明るい色素をを提供し、更なる改善に努めています。

TregのIL-2刺激に対する感受性

TregのIL-2刺激に対する感受性

ヒトPBMCをIL-2で刺激後、細胞表面染色、固定膜透過処理、細胞内染色し、解析を行った。他のT細胞と比較してTregのリン酸化Stat5は低濃度IL-2領域で反応を示している。

BD バイオサイエンスは、様々なシグナル伝達の解析を行うために、細胞表面と細胞内抗原に対する抗体を、複数の条件や緩衝系、染色プロトコルで検証し本ウェブサイトに情報を蓄積しています。

また、使い易いReady to useのキット製品もご提供しています。
B細胞、T細胞、単球、NK細胞をヒト全血から解析する、Human monocyte/NK cell activation キット(Cat. No. 562089)とCD4 T細胞CD8T細胞解析用のHuman T-cell activation キット (Cat. No. 560750)をご用意しています。

キット製品には、以下の製品が含まれています。

  • 細胞表面マーカーに対する蛍光標識抗体カクテル
  • リン酸化タンパクに対する蛍光標識抗体
  • 最適なバッファー類
  • 最適なバッファー類
  • 陽性コントロール及び陰性コントロール細胞
  • プロトコル

ヒト白血球サブセットにおけるIL-4刺激に対するStat5 及びStat6シグナル伝達解析例

ヒト白血球サブセットにおけるIL-4刺激に対するStat5 及びStat6シグナル伝達解析例

ヒト全血をIL-4で刺激後、BD Phosflow human monocyte/NK cell activation kitを用いて固定膜透過処理及び染色を行った。IL-4刺激に対するStat6 (pY641)及びStat5 (pY694)のリン酸化解析では、TBMNKのすべてのサブセットにおいてStat6のリン酸化が見られたが、Stat5についてはNK細胞を除くTBM細胞サブセットでリン酸化が観察された。


1 Szabo SJ, Sullivan BM, Stemmann C, Satoskar AR, Sleckman BP, Glimcher LH. Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-gamma production in CD4 and CD8 T cells. Science. 2002;295:338-342.

2 Intlekofer AM, Takemoto N, Wherry EJ, et al. Effector and memory CD8+ T cell fate coupled by T-bet and eomesodermin. Nat Immunol. 2005;6:1236-1244.

従来の手法と異なり、細胞内フローサイトメトリーの技術は、性質の異なる複数のタンパクを単一細胞レベルで同時に解析することができます。

シグナル伝達反応や、分化状態、様々な細胞内のイベントを解析することができます。BDでは、様々なタンパクの検出を簡単に行うためのキットやバッファー、豊富な抗体製品ラインをご提供しています。特に抗体に関しては、様々な条件、バッファーに対応する蛍光標識抗体をご用意しております。また、サイトカイン産生能の解析においては、何千という文献で引用されている実績があります。


下記は、ヒト全血をIL-2で刺激誘導をかけ、Stat5のリン酸化解析を行った例です。各々のマーカーの表現型により、naïve、effector、memory T 細胞集団を同定しています。 細胞表面マーカーに加え、IFN-gの産生に関与する転写因子T-betの解析を合わせて行うことで、NK細胞、CD8 effector T 細胞、CD4 T helper 1 (Th1)細胞を特定することができます。1,2

この実験系では、IL-2に対する感受性が細胞集団によって異なることが観察されました。例えば、Th1-like 及び non-Th1 effector/memory CD4 T細胞サブセット(F, E)は、IL-2低濃度領域で反応を示しますが、 naïve CD4 T細胞 (D)及びnaïve CD8 T細胞(A)はより高濃度領域でStat5のリン酸化が誘導されています。

IL-2 刺激を行ったT細胞サブセット解析例

IL-2 刺激を行ったT細胞サブセット解析例

ヒト全血をIL-2の濃度条件を変化させて刺激を行い、固定透過処理後染色を行った。T細胞サブセットのデータを示す。

転写因子やサイトカイン、表面マーカー発現レベルの同時解析は、ヘルパーT 細胞の分化や機能を理解する上で非常に重要です。RORγtはTh17細胞の重要な転写因子ですが、IL-17の分泌と CD4+CD8+ 胸腺細胞の維持に関わっています。1,2

下記の実験では、BALB/cマウスの胸腺及び脾臓の細胞を、CD44、CD62L及びCD196の胞表面マーカー特異抗体あるいはアイソタイプコントロールで染色した。BD Pharmingen transcription factor buffer setで細胞を固定膜透過処理後、RORγt、Foxp3、IL-17A及びIFN-γの特異抗体で細胞内染色を行った。

パネルAは、IL-17Aの発現をRORγt, Foxp3 (Treg の転写因子)とIFN-γ (Th1 サイトカイン) の発現と比較しています。胸腺細胞においては、IL-17A+ RORγt+細胞が多く観察され、IL-17A とFoxp3あるいはIFN-γの共発現は低いことが確認できます。脾臓細胞においては、IL-17Aの発現レベルが低いことが確認されます。

パネル(B)では、脾臓におけるIL-17A産生細胞では、CD44及びCD196 (CCR6)の発現が高く、CD62Lの発現は低いことが観察されます。


BALB/c マウスにおける胸腺及び脾臓のTh17 細胞解析

BALB/c マウスにおける胸腺及び脾臓のTh17 細胞解析

胸腺及び脾臓の細胞を、細胞表面染色後、BD Pharmingen transcription factor buffer setで固定膜透過処理し、RORγt, Foxp3などの細胞内マーカー染色した。


1 Ghoreschi K, Laurence A, Yang XP, Hirahara K, O’Shea JJ. T helper 17 cell heterogeneity and pathogenicity in autoimmune disease. Trends Immunol. 2011;32:395-401.

2 Ivanov II, McKenzie BS, Zhou L, et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 2006;126:1121-1133.

細胞膜透過

エピトープのロケーションによって、適切な細胞膜透過処理は変化する

サイトカイン検出

CD8+細胞においてのIFN-γ とIL-2 の産生

サイトメガロウィルス(CMV) pp65によりCD4+CD69+T細胞を刺激した時の抗原特異的IFN-γ産生

転写因子

細胞内のフローサイトメトリーによるヒト Tregの解析

H9 hESCの内胚葉分化解析

リン酸化タンパク

TregのIL-2刺激に対する感受性

ヒト白血球サブセットにおけるIL-4刺激に対するStat5 及びStat6シグナル伝達解析例

多項目同時解析

IL-2 刺激を行ったT細胞サブセット解析例

BALB/c マウスにおける胸腺及び脾臓のTh17 細胞解析

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